8种五加属植物根皮中五加酸和贝壳烯酸的RP-HPLC法定量分析

建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定五加酸和贝壳烯酸的定量分析方法,利用最优色谱条件对8种中韩五加属植物根皮中的五加酸和贝壳烯酸进行定量分析。研究结果表明,最佳色谱条件为:ODS-C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水(0～60min时乙腈含量为10%→100%,60～70min时乙腈含量为100%);检测波长为207nm;柱温为30℃;流速为1.0mL/min。五加酸和贝壳烯酸线性范围分别为:0.1070～0.5351g/L(相关系数r=0.9999)和0.0930～0.4649g/L(r=0.9998),加样回收率分别为97.93%(标准偏差为1.33%)和98.12%(标准偏差为1.16%)。

RP-HPLC法测定糙叶五加不同部位中五加酸和贝壳烯酸含量

为了建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定糙叶五加不同部位中五加酸和贝壳烯酸的定量分析方法,本研究采用RP-HPLC外标法测定了五加酸和贝壳烯酸含量。所用色谱柱:ODS-C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水(0～60min时乙腈含量为10%～100%,60～70min时乙腈含量为100%);检测波长207nm;柱温30℃;流速1.0mL/min。结果表明:在上述色谱条件下,五加酸和贝壳烯酸获得良好分离,线性范围分别为:0.1070～0.5351g/L(相关系数r=0.9999)和0.0930～0.4649g/L(r=0.9998),加样回收率分别为97.93%(标准偏差为1.33%)和98.12%(标准偏差为1.16%)。糙叶五加根、茎、叶中五加酸的平均含量(n=3)分别为:39.90、19.72、49.19μg/g;贝壳烯酸的平均含量(n=3)分别为:21.01、21.70、25.88μg/g。由此可知,该方法准确性高,重现性好,为糙叶五加的质量控制提供了可借鉴的定量分析方法。

贝壳杉烯酸诱导烟草的系统获得性抗性防御番茄斑萎病毒侵染

【目的】番茄斑萎病毒(TSWV)在全球范围内广泛发生,危害多种作物引起严重的经济损失,筛选应用具有高效抑制活性的天然产物是防控TSWV引起的病害有效途径之一。前期研究发现三列叶蟛蜞菊(Wedelia trilobata)中提取的贝壳杉烯酸(AHK)具有抑制TSWV侵染的活性,本研究探明其具体的抑制机制。【方法】通过测定接种TSWV前、后用AHK处理的烟草植株相关防御酶活性以及RT-qPCR检测抗性相关主要代谢通路关键转录因子基因表达量,解析AHK防御TSWV侵染的机制。【结果】AHK在病毒接种前后处理中能诱导超氧化物歧化酶(SOD)活性升高而抑制TSWV的侵染;同时AHK能诱导茉莉酸(JA)通路重要转录因子MYC2、NAC表达量升高,增强了系统获得抗性。【结论】AHK主要通过诱导SOD酶活升高以及诱导JA通路增强寄主系统抗性从而抑制TSWV的侵染,具有作为植物源农药研发的潜力,为TSWV引起的病毒病绿色防控积累基础。

五加皮的薄层鉴别和异贝壳杉烯酸的含量测定

目的建立五加皮药材的薄层鉴别方法和含量测定方法，为五加皮的质量控制提供科学依据。方法采用薄层色谱法，以异贝壳杉烯酸和对照药材为对照，以石油醚-丙酮-异丙醇-甲酸（12：2：0．5：0．1）为展开剂，建立了其定性鉴别方法；采用高效液相色谱法，以异贝壳杉烯酸为对照，PhenomenexC18（100mm×4．6mm，2．6μm）为色谱柱，乙腈-水（50．2：49．8）为流动相，蒸发光散射检测器（ELSD）为检测器建立了其含量测定方法。结果在建立的薄层色谱上，五加皮样品、五加皮对照药材以及对照品在相应的位置，均显相同颜色的斑点，而香加皮对照药材未见该对照斑点。含量测定方法学考察表明，异贝壳杉烯酸在2．01—40．12μg质量范围内进样质量对数与峰面积对数呈良好的线性关系（R2=0．9998），平均加样回收率为101．21％，RSD为1．46％（n=6）；异贝壳杉烯酸的含量以干燥品计为0．70％～2．17％。结论所建立的薄层色谱鉴别法专属性强，能较好的区别五加皮及其伪品。建立的HPLC含量测定方法准确度高，可用于五加皮的质量控制。

高效液相色谱-二极管阵列检测器法测定食用土当归总有机酸中贝壳杉烯酸及海松酸含量

目的建立测定食用土当归总有机酸中贝壳杉烯酸及海松酸含量的高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法。方法采用反相高效液相色谱法,使用YMC-Pack ODS-AQ色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.1%磷酸水溶液(76∶24)为流动相,检测波长为202 nm,流速为1.0 mL/min,柱温为30℃,进样量为15μL。结果贝壳杉烯酸及海松酸进样量分别在2.257~4.514μg(R^2=0.999 6)和2.839~5.678μg(R^2=0.999 6)范围内与峰面积线性关系良好,平均回收率分别为100.30%和99.65%,RSD分别为1.68%和1.46%。10批食用土当归总有机酸中贝壳杉烯酸和海松酸的平均含量分别为19.23%和27.64%,同时食用土当归总有机酸中贝壳杉烯酸含量均不低于17.00%,海松酸含量均不低于24.00%。结论本研究中采用HPLC-DAD法首次测定了食用土当归总有机酸中贝壳杉烯酸及海松酸含量。该方法简便、灵敏、准确、重复性好,为食用土当归总有机酸质量标准的制订奠定了基础。

簕菜中贝壳杉烯酸的测定

目的:建立超高效液相色谱-质谱法(LC-MS)测定簕菜中贝壳杉烯酸的含量。方法:样品经过干燥处理后,用甲醇进行提取,采用高效液相色谱-质谱法进行定量检测。结果:贝壳杉烯酸在1.0~20.0μg·mL^-1范围内的相关系数R^2达到0.993 5;簕菜样品贝壳杉烯酸含量测定的重复性试验RSD为3.3%,回收率范围为90.5%~108.2%。结论:本方法检测簕菜中的贝壳杉烯酸含量,具有快速、准确、处理简单的特点。

梨贝壳杉烯酸氧化酶基因PcKAO1的克隆与表达分析

以梨矮化砧木‘中矮1号’新梢叶片为试材,根据苹果基因组中相关序列信息设计特异引物,通过RT-PCR的方法克隆了梨赤霉素合成过程中关键酶——贝壳杉烯酸氧化酶(KAO)基因的编码框全长序列。该序列全长1568bp,开放阅读框(ORF)编码503个氨基酸,相对分子量为57.59kD,等电点为9.47,氨基酸序列与其它物种已知的KAO序列具有53.14%～98.61%的相似性,且具有细胞色素P450家族蛋白典型的功能结构域和跨膜结构域,将该基因命名为PcKAO1,GenBank登录号为KC153027.1。用同样的方法克隆了对照梨品种‘早酥’(乔化)和‘锦香’(半矮化)的PcKAO1基因,通过比对分析发现3个品种的PcKAO1基因间仅有个别碱基差异,其编码的蛋白序列完全一致。RT-PCR半定量分析表明:PcKAO1基因在‘中矮1号’各个检测的器官组织中均有表达,其中以种子和子房中的表达量最高;在3个品种的新梢叶片中,除新梢生长初期(5月10日)之外,其他时期矮化砧木‘中矮1号’均低于乔化和半矮化的对照品种‘早酥’和‘锦香’,而在这些时期‘中矮1号’新梢生长逐渐减缓乃至停长。

雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因的全长cDNA克隆与表达分析

贝壳杉烯酸氧化酶(kaurenoic acid oxidase)是二萜赤霉素生物合成途径上的关键酶,参与植物生长发育等重要生物学过程。该文根据雷公藤转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术克隆得到贝壳杉烯酸氧化酶全长c DNA序列,并进行生物信息学分析;使用实时定量PCR(qRT-PCR)研究基因的诱导表达水平。克隆得到Tw KAO长度为1 874 bp,编码487个氨基酸,蛋白相对分子质量56.02 k Da,理论等电点8.89;经茉莉酸甲酯(Me JA)诱导后,Tw KAO基因相对表达量在12 h达到峰值;经植株组织表达分析证实,Tw KAO基因在雷公藤的叶中表达量最高,根中最低。该研究首次克隆得到雷公藤KAO基因,并分析其mRNA表达特征,为深入研究雷公藤生长发育以及萜类活性成分次生代谢研究奠定基础。

食用土当归有机酸成分的抑菌性研究

目的:研究食用土当归有机酸成分的抑菌性。方法:以食用土当归为试材,采用牛筋杯法对其提取物贝壳杉烯酸、海松酸和总有机酸的抑菌活性进行初步研究。结果:贝壳杉烯酸、海松酸、总有机酸对6种细菌均表现出一定的抑制作用;铜绿假单胞菌中抑菌圈直径大于大肠埃希菌、金色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌抑菌圈的直径。结论:食用土当归有机酸成分具有一定的抑菌活性,对铜绿假单胞菌的抑菌作用更为明显。

鞘蕊苏贝壳杉烯酸氧化酶基因的克隆及表达载体的构建

为提高鞘蕊苏有效成分的含量,开展Coleus Ent-kaurenoic acid oxidase（KAO）基因的克隆以及表达载体构建方面的研究。提取鞘蕊苏叶片的总RNA,利用套式PCR技术克隆获得KAO基因全长,将该基因连接到克隆载体p MD-18T,经测序鉴定正确后,再将该基因连接到p ET-28a表达载体中。结果显示,成功克隆出的鞘蕊苏KAO基因大小为1 500 bp,对克隆基因进行测序及酶切鉴定,均得到正确大小的DNA片段,说明表达载体构建成功。本研究成功克隆得到鞘蕊苏贝壳杉烯酸氧化酶基因并构建其表达载体,为提高鞘蕊苏有效成分含量提供了基础。

基于多波长切换HPLC同时测定五加皮中10个成分研究

目的:建立多波长切换HPLC法同时测定五加皮多指标质量评价方法。方法:采用Waters AtlantisTMT3色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(0~15 min,10%A→20%A;15~25 min,20%A→40%A;25~30 min,40%A→85%A;30~45 min,85%A),流速1.0 mL·min^(-1),柱温35℃,检测波长为277 nm(0~30 min,检测新绿原酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸A、异绿原酸C)、202 nm(30~45 min,检测异贝壳杉烯酸),进样量为20μL。结果:在优化的色谱条件下,新绿原酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸A、异绿原酸C、异贝壳杉烯酸的质量浓度分别在1~100μg·mL^(-1)(r=1.000)、0.5~50μg·mL^(-1)(r=1.000)、0.25~25μg·mL^(-1)(r=1.000)、3.75~375μg·mL^(-1)(r=0.9999)、0.25~25μg·mL^(-1)(r=0.9999)、0.25~25μg·mL^(-1)(r=0.9999)、0.25~25μg·mL^(-1)(r=1.000)、2~200μg·mL^(-1)(r=0.9998)、0.5~50μg·mL^(-1)(r=0.9999)、14.45~1445μg·mL^(-1)(r=0.9998)范围内均呈现良好的线性关系,精密度、重复性和稳定性的RSD均<3%,加样回收率(n=6)为90.4%~104.0%,RSD为0.4%~2.4%。11批样品中上述成分含量范围分别为0.03~0.19,0.06~0.87、0.02~0.48、0.16~4.51、0.04~0.20、0.04~0.13、0.02~0.45、0.04~3.03、0.22~1.03、5.26~21.18 mg·g-1。结论:所建立的五加皮多指标质量评价方法快速、准确,有较好的重现性和稳定性,可用于五加皮的质量评价研究。