贝莱斯芽孢杆菌HN-1突变体文库的构建及Arp基因的鉴定

贝莱斯芽孢杆菌HN-1是一株对香蕉枯萎病4号生理小种尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)具有良好抑制活性的生防芽孢杆菌。本研究旨在构建生防菌HN-1的突变体库,在突变体库的基础上深入研究生防芽孢杆菌的抑菌机理,针对香蕉枯萎病的生物防治夯实理论基础。将携带转座子TnYLB-1的温敏型质粒载体pMarA质粒利用化学法转化进入贝莱斯芽孢杆菌HN-1中,通过50℃高温诱导后构建了由1 800个HN-1突变体组成的贝莱斯芽孢杆菌HN-1突变体文库,质粒消除率达99.7%。通过平板抑菌法筛选得到一株对尖孢镰刀菌Foc4的抑制活性降低的突变体,利用反向PCR技术确定插入破坏的基因与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株FZB42 arsenic resistance protein (RBAM-550730)基因同源性为99%,在系统进化树中与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株FZB42中的该基因属于同一分支。通过筛选鉴定HN-1突变体文库中抑菌活性丧失突变体发现HN-1中Arp基因与生防芽孢杆菌HN-1抑制尖孢镰刀菌的活性有密切的关系。

短小芽孢杆菌HN-10抗菌肽P-1对粉红单端孢细胞膜结构和活性氧代谢的影响

粉红单端孢(Trichothecium roseum)是多种植物及采后果蔬重要的病原菌,该文探讨了短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)HN-10抗菌肽P-1对粉红单端孢细胞膜结构以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)代谢的影响。通过平板培养(牛津杯法)和液体培养体系考察了B.pumilus HN-10抗菌肽P-1对粉红单端孢菌体生长的抑制作用;采用碘化丙啶染色和透射电镜技术,动态观察了抗菌肽P-1对液态培养12 h的内粉红单端孢细胞壁、膜结构的影响;通过液态培养试验体系,分析了抗菌肽P-1对膜通透性的影响,并基于膜脂过氧化反应研究了抗菌肽P-1对粉红单端孢ROS及其代谢产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的影响。结果表明,固态、液态培养的粉红单端孢菌体生长受到明显抑制,随着抗菌肽P-1处理时间的延长,粉红单端孢孢子数逐渐增多,抗菌肽P-1对粉红单端孢孢子壁、膜造成了局部损伤,并出现缺口,导致细胞质大量流出,孢子变形。抗菌肽P-1处理使得菌体麦角甾醇的含量减少,第7天时,比对照组低35%。同时,抗菌肽P-1处理显著增大了N-苯基-1-萘胺的摄取率、相对电导率,第7天时,分别比对照组高24%、35%。此外,抗菌肽P-1处理使胞内·O_(2)^(1)含量显著增高(P<0.05),引起了细胞抗氧化超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶系统平衡的破坏,加剧了脂质过氧化和蛋白羰基化程度,MDA含量增加,最终抑制了菌体的生长。

复合菌剂防治草莓根腐病的效果研究

为了获得草莓根腐病病原菌新棒状拟盘多毛孢(Neopestalotiopsis clavispora)的拮抗菌,筛选出3株生防效果好的菌株:贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis-17)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefacen-27)和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis-Y1-7),进行室内目标病原菌的平板对峙试验和生防效果的广谱性验证试验,对抑菌圈边缘菌丝进行10×4倍和10×10倍的显微镜观察,检测3株生防菌的代谢产物中是否含有吲哚乙酸(indoleacetic acid,IAA)和铁载体等促生物质和脂肽活性类抗病物质,并设计盆栽和田间试验检测其防病、促生和增产效果。室内平板对峙试验显示,供试3株生防菌均对目标病原菌及草莓灰霉病等6种病原菌有拮抗效果,抑菌圈边缘菌丝出现变细、扭曲、分支增多等畸形现象。3株生防菌均产生促生物质IAA和铁载体,菌株胞外粗提物具有拮抗拟盘多毛孢的效果,以上结果初步证明3株生防菌均具有促生抗病潜力。盆栽试验表明,同一生防菌的防病效果优于抗病效果,复合菌的防病促生效果优于单一菌株,防治效果高达73.68%。田间试验表明,复合菌处理防病增产效果较优,防治效果高达57.18%~66.00%,每公顷增产12.97%~37.99%。盆栽和田间试验印证了3株生防菌分别具有促生防病及增产效果,以3株生防菌复合效果最优。