免疫磁珠负性富集结合免疫荧光抗体技术检测卵巢癌患者外周血CTCs的方法建立和应用

目的建立基于细胞学水平的循环肿瘤细胞负性富集技术来检测卵巢上皮性癌(卵巢癌)患者外周血循环肿瘤细胞。方法体外培养卵巢癌SKOV-3细胞,按一定比例掺入到2 ml健康人外周静脉血中,应用免疫磁珠为基础的负性富集结合免疫荧光抗体技术对循环肿瘤细胞进行定量检测。评价该方法富集靶细胞的回收率,并用上述方法检测32例卵巢癌患者和10例对照者外周血中的循环肿瘤细胞。结果①在健康志愿者2 ml外周血掺入不同数目SKOV-3细胞的条件下,肿瘤细胞的回收率在64%~80%之间,掺入细胞间回归方程为Y=0.782X-1.408,相关系数为0.998。②10例对照者外周血中未检测到CK8/18+,18例卵巢癌患者的外周血中检测到CK8/18+,阳性率为56.3%(18/32,X^2=7.681,P<0.01)。③CTCs阳性与远处转移密切相关(X^2=5.776,P<0.05)。结论免疫磁珠负性富集结合免疫荧光抗体技术检测卵巢癌患者外周血循环肿瘤细胞的方法可能具有一定的临床应用价值。

建立基于循环肿瘤细胞上的RNA原位杂交技术

目的:循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是一种重要的体液生物标志,通过检测C T C的数量及其表型可以动态了解肿瘤进展.本研究建立一种基于CTC细胞滴片上的RNA原位杂交方法,分析CTC表型间接了解肿瘤进展.方法:采用负性富集技术获得肝细胞肝癌患者外周血CTC等有核细胞的细胞滴片,并在CTC滴片上尝试建立RNA原位杂交技术.选择真核生物高度保守的肽基脯氨酰顺反异构酶B(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B,PPIB)基因作为阳性对照,合成针对PPIB基因高灵敏度的RNA杂交探针,并在实体肿瘤患者外周血CTC滴片中检测PPIB基因的转录活性.结果:用于外周血有核细胞负性富集的多种试剂,均不影响在CTC滴片上的RNA原位杂交,最终优化了对传统CTC滴片细胞的固定方式和固定时间,实现了在负性富集的肝细胞肝癌CTC滴片上的PPIB基因原位RNA杂交,获得了CTC细胞中PPIB基因转录信息,建立了实时动态监测实体肿瘤患者外周血CTC中特定基因转录活性的方法.结论:缩短采血到固定细胞的时间以减少RNA降解,通过高灵敏探针的RNA原位杂交可以实现对CTC中特定基因转录水平的实时监测.

肝细胞肝癌外周血循环肿瘤细胞的检测

目的初步探讨肝细胞肝癌外周血循环肿瘤细胞的检测效果。方法收集50例经单纯手术切除治疗的肝细胞肝癌患者术前外周血，分别采用纳米磁珠负性富集和Captor^TM无标记捕获系统分离与富集外周血循环肿瘤细胞，采用上皮细胞和肝细胞肝癌组合标记的免疫荧光染色鉴定循环肿瘤细胞，探讨循环肿瘤细胞分离、富集和鉴定的效果，观察患者手术前后循环肿瘤细胞的数量变化。结果纳米磁珠负性富集和Captor^TM无标记捕获系统均可有效分离和富集肝癌患者外周血循环肿瘤细胞。单纯手术治疗的肝细胞肝癌患者术前外周血经纳米磁珠负性富集后循环肿瘤细胞检出率为96．0％（48／50），7．5ml外周血循环肿瘤细胞中位数为16个。术后7．5ml外周血循环肿瘤细胞中位数为17个，术前为23个，差异有统计学意义（P=0．041）。结论采用纳米磁珠负性富集和Captor^TM无标记捕获系统均能有效分离和富集肝细胞肝癌外周血循环肿瘤细胞，手术前后循环肿瘤细胞数目存在差异，动态检测肝癌患者外周血循环肿瘤细胞可辅助了解肿瘤进展。