乙型肝炎病毒正链负性调节元件的亚元件鉴定

目的研究乙型肝炎病毒正链负性调节元件（HBVnt453～250）中存在的重要功能亚元件。方法通过构建pHBVnt453～250质粒一系列缺失10 bp的突变体,与内参pRL-TK质粒共转染HepG2细胞,于转染后48 h检测荧光素酶活性并确定亚元件的位置和序列。构建亚元件与pGL3-control载体质粒的重组质粒,与内参pRL-TK质粒共转染HepG2细胞并检测荧光素酶活性,半定量RT-PCR检测荧光素酶的mRNA水平。结果与pHBVnt453～250对照组比较,6个缺失突变体实验组的荧光素酶活性恢复到60%～80%,鉴定出3个功能亚元件。这3个亚元件的重组质粒荧光素酶活性比pGL3-control对照组降低,半定量RT-PCR显示荧光素酶的mRNA水平降低。结论HBVnt453～250序列中含有3个重要功能亚元件,以协同的方式发挥调节抑制作用。

HBVnt453-250负性调节元件作用方式与嗜肝性的研究

目的HBVnt453-250序列为乙型肝炎病毒正链的-个新的负性调节元件，探讨其作用方式是否具有方向位点依赖性、启动子选择性以及肝细胞特异性。方法构建含有负性调节元件的质粒pHBV453-250方向和位点置换体（pHBV250-453、plucHBV453-250和plucHBV250-453），分别以荧光素酶（1uciferase）及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告基因，转染HepG2细胞后，通过双荧光素酶体系、荧光定量PCR和Westernblot分析，检测HBVnt453-250序列对目的基因转录及表达的影响；构建启动子置换的质粒pCMV453-250（1uc），转染HepG2细胞后，双荧光素酶检测系统检测荧光素酶表达；将pHBV453—250和pHBV250-453分别转染人宫颈癌细胞（HeLa）和人肺癌细胞（A549），双荧光素酶检测系统检测荧光素酶表达。结果HBVnt453-250序列以正向或反向插入荧光素酶或EGFP基因的5’端或3’端时，均能表现对目的基因转录和表达的下调作用；在CMV启动子引导下，HBVnt453-250序列明显降低了荧光素酶的活性，为对照的36．56％；正反向的HBVnt453-250序列均能在两种非肝源性细胞系中抑制荧光素酶活性。结论HBVnt453-250序列的负性调节作用无方向及位点特异性，无启动子选择性及肝细胞特异性。