扫描及负染电镜在兔脑炎原虫病诊断中的应用

12只临床表现头颈歪斜、昏睡、震颤、局部或全身轻瘫的可疑为兔脑炎原虫病的獭兔 ,对其肾脏皮髓交界和尿沉渣分别进行了扫描电镜和负染电镜观察 ,看到了大小为 1～ 1 .5× 1 .4～ 2 .5μm,形态呈卵圆形和杆状的兔脑炎原虫。阳性检出率为 1 0 0 %。说明扫描及负染电镜术是诊断兔脑炎原虫病的一种较为可靠的技术。

核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物的负染电镜结构分析

目的·利用负染电镜技术分析人源核小体重塑及组蛋白去乙酰化酶复合物(nucleosome remodeling and deacetylase complex,NuRD复合物)结构,获得人源NuRD复合物的轮廓信息。方法·将C端带有3×Flag标签的MBD3(methyl-CpG binding domain protein 3)和N端带有10×His标签的GATAD2A(GATA zinc finger domain containing 2A)克隆至pMLink表达载体中,采用聚乙烯亚胺瞬时转染过表达的方式在人源Expi293F悬浮细胞里表达NuRD复合物中的蛋白质组分;依次通过Ni-NTA亲和层析、Flag(DYKDDDDK)标签亲和层析和Superose 6 Increase 5/150凝胶过滤层析分离纯化NuRD复合物;利用蛋白质印迹法(Western blotting)和液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对复合物进行组分鉴定;利用负染电镜技术结合单颗粒重构技术研究NuRD复合物的空间结构;通过UCSF Chimera软件将蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)中已有亚复合物的原子结构模型(7AO9,5FXY)与生成的结构模型进行自动匹配及比对,预测多个蛋白组分在负染结构模型中的定位。结果·利用两步亲和层析,成功富集了带有纯化标签的MBD3、GATAD2A蛋白及其他内源蛋白组分,通过进一步的凝胶过滤层析分离得到了均一性良好的复合物;通过Western blotting和LC-MS/MS鉴定,确认纯化得到的复合物为组分完整的人源NuRD复合物。利用负染电镜技术及单颗粒重构技术初步解析了NuRD复合物的空间结构,其整体轮廓特征明显,呈现为不对称的长条形;通过进一步的三维优化处理,最终获得了人源NuRD复合物分辨率约为17A(1A=0.1 nm)的初步三维结构模型;已有的亚复合物原子结构模型(PDB:7AO9,5FXY)与NuRD复合物的初步三维结构模型自动匹配后,初步确定了MTA1/2/3(metastasis-associated protein 1/2/3)、HDAC1/2(histone deacetylase 1/2)、RBBP4/7(retinoblastoma-binding protein 4/7)及MBD2/3(methyl-CpG-binding domain protein 2/3)蛋白亚基在NuRD复合物负染结构模型中的定位。结论·利用单颗粒重构技术搭建了人源NuRD复合物的低分辨率负染结构模型。

急性病毒性坏死症病毒在栉孔扇贝不同器官的感染状况

应用超薄切片、负染电镜技术以及ＥＬＩＳＡ对自然发病和人工感染发病的栉孔扇贝之外套膜、鳃、肝胰腺、肾、肠、及闭壳肌等主要器官急性病毒性坏死症 (ＡｃｕｔｅＶｉｒｕｓＮｅｃｒｏｂｉｏｔｉｃＤｉｓｅａｓｅ,ＡＶＮＤ)病毒的感染状况进行了研究。三种检测方法均表明 ,病贝的外套膜及肝胰腺为ＡＶＮＤ病毒感染最严重的器官 ,肾以及肠组织次之 ,鳃及闭壳肌病毒感染程度最轻。本结果同时表明 ,ＡＶＮＤ病毒在病贝体内广泛分布 ,侵染的细胞主要为上述器官皮下肌细胞的细胞质内 ,侵染细胞超微结构表现为生物膜肿胀 ,并出现“髓袢样”

栉孔扇贝病原感染与病害发生关系探讨

利用电镜负染技术检测自然海区养殖和人工感染试验的栉孔扇贝组织提取液,分别发现病毒和类立克次氏体(RLO)两种病原体。动态检测两类病原体感染状况与整个养殖期间栉孔扇贝发病死亡情况,结果表明,养殖期间病毒感染率在80%～100%之间,最大感染强度出现在栉孔扇贝大规模死亡的7、8月份。人工感染病毒的栉孔扇贝,其病毒感染率和感染强度与养殖栉孔扇贝大规模死亡时期相当。而两种情况下栉孔扇贝类立克次氏体的感染率和感染强度均未见明显变化。综合分析表明,病毒可能是造成栉孔扇贝大规模死亡的直接病原体。

腹泻病患者感染小圆结构病毒的检测、鉴定与初步调查

以兔抗小圆结构病毒 (SRSV)超免疫血清作为包被抗体 ,建立了可对腹泻粪便样品中SRSV进行直接检测的间接ELISA方法。应用该方法 ,对北京地区 1998～ 1999年秋冬季收集到的 45人份的腹泻粪便样品 ,进行了SRSV存在情况的检测及腹泻人群中SRSV感染情况的初步调查。结果表明 ,有 1份粪便样本呈SRSV强阳性 ,有 2份为微弱阳性。经负染电镜观察进一步鉴定 ,在ELISA强阳性样本中可见到典型的SRSV样病毒颗粒。两种方法均可在腹泻粪便样品中检测鉴定出SRSV的存在 ,并反映出在北京地区 1998～ 1999年秋冬季人群中有SRSV散发感染的情况 ,且SRSV感染占腹泻发病患者的比例约为 2 2 %。

892例人腹泻病毒病原的电镜快速诊断及应用

应用电镜负染法对成人和小儿腹泻的粪便病料进行了直接观察，检测出轮状病毒、冠状病毒、腺病毒和肠道病毒，并发现有些病例有两种以上的病毒感染，有的病料中还发现病毒抗原、抗体复合物。与ＥＬＩＳＡ和荧光抗体法（ＦＡ）相比较，其检出率一致。电镜诊断具有直观、快速、简便等优点，尤其对一些难以进行组织培养和至今还未建立有效诊断方法的病毒引起的疾病，是一种不可缺少的诊断手段。

人源THOC1-THOC2-THOC3亚复合物的电镜结构研究

目的·利用负染电镜技术分析人源THO亚复合物结构。方法·采用共表达方式在培养的昆虫细胞里表达重组蛋白质组分,利用Ni-NTA亲和层析、Strep-Tactin亲和层析纯化和Superose凝胶过滤层析分离目的蛋白质复合物;通过负染电镜技术和单颗粒重构技术研究THO亚复合物的空间结构。结果·利用两步亲和层析纯化及一步凝胶过滤层析分离获得高纯度的、均一性良好的重组人源THOC1-THOC2-THOC3亚复合物;采用甲酸双氧铀负染后利用电镜技术初步分析了目的复合物的空间结构。结论·利用单颗粒重构技术构建了人源THOC1-THOC2-THOC3复合物的低分辨率模型。

人源MDN1蛋白质的电镜结构研究

目的·利用负染电镜技术分析人源midasin AAA-ATPase 1(MDN1,又称Rea1)蛋白质结构。方法·利用CRISPR/Cas9基因编辑方法在Expi293F细胞内源MDN1蛋白质的氨基端敲入3×FLAG纯化标签,采用ANTI-FLAG^(®)M2 Agarose Affinity Gel亲和层析和甘油密度梯度离心的方法分离纯化目的蛋白质;通过负染色电镜技术和单颗粒(single-particle)重构技术探究人源MDN1蛋白质结构。结果·利用亲和层析及密度梯度离心方法分离纯化获得高纯度、均一性较好的人源MDN1蛋白质样品;采用甲酸铀负染色后利用120 kV电镜初步解析了目的蛋白质MDN1的空间结构。结论·利用单颗粒重构技术搭建了人源MDN1蛋白质的低分辨率的负染模型。

犬瘟热、犬冠状病毒联合RT-PCR检测方法的建立及应用

用CDV、CCV特异性引物对同一样品中CDV和CCVRNA模板进行联合RT PCR扩增 ,并对扩增条件进行了优化。结果同时得到了两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带 ,且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。敏感性试验表明 ,该联合PCR能检测出 10 - 4倍稀释的CDV模板 (10 6 6 TCID50 / 0 1mL)和 10 - 3倍稀释的CCV模板 (10 5 9TCID50 /0 1mL)。通过对 7份临床发病犬病料的检测 ,其阳性检出率高于电镜负染检查。初步应用表明 ,此法具有高度敏感、特异、准确、快速等特点 ,适用于兽医临床对CDV。

云南省唐菖蒲花叶病的鉴定研究

对云南省的唐菖蒲花叶病进行调查和病样采集 ,通过鉴别寄主反应、电镜负染观察、免疫双扩散实验证实此病原为黄瓜花叶病毒CMV .

崇明芋花叶病毒病的初步鉴定

芋花叶病毒病是造成天星科植物产量下降,品质劣变的主要原因。作者通过田间调查、电镜负染和核酸斑点杂交的方法,分析了崇明特产品种崇明香酥芋和崇明县主栽品种浙江红梗芋芋花叶病毒病(Dasheenmosaicvirus,DMV)的发病情况,初步推断崇明县境内芋艿已被芋花叶病毒侵染,并探讨了用茎尖分生组织培养生产脱除DMV种苗的必要性。

臭氧氧化法污泥减量技术的试验研究

对臭氧氧化法污泥减量技术进行了试验研究。试验表明,污泥浓度和臭氧流量均会影响污泥减量效果。当SV%=40,Qo2=20L/h,氧污比为0.15gO3/gMLSS时,污泥去除率最高,达到67.95%,污泥浓度与时间的函数关系为:S=3209.60e-0.1428t(S—MLSS浓度,mg/L;e—指数常数t;—时间,h)。电镜观察表明,经过臭氧氧化,污泥菌胶团密度降低,丝状菌网状结构破坏,细胞质溶出,细胞量明显减少。臭氧氧化法污泥减量技术对于解决污泥问题具有指导意义。

犬冠状病毒在犬体内分布的初步研究

对电镜检查粪便中发现有犬冠状病毒的 4只犬 ,进行了血常规、尿常规、肝肾功能和心电图检查 ,均未发现明显异常。扑杀后经电镜负染检查 ,除肠内容物外 ,在其肝、心、脾。

猪传染性胃肠炎的诊断及防治措施

本文主要对猪传染性胃肠炎的病原、流行特点、临床症状、病理变化和防治措施做一概述,希望可以对养殖户防治猪传染性胃肠炎提供一定帮助。1病原该病的病原为猪传染性胃肠炎病毒,为单链RNA病毒,可呈圆形、椭圆形或多边形,直径60~160纳米,有囊膜,表面有一层长12~28纳米的棒状纤突。透射电镜观察可见病毒粒子位于内质网腔内,多呈圆形,磷钨酸负染电镜下可见粒子四周有花环样凸起。

鲍曼不动杆菌外膜囊泡的提取、纯化及活性检测

目的提取并纯化鲍曼不动杆菌(AB)标准株ATCC17978的外膜囊泡(omv),观察其形态、结构并检测其活性。方法常规培养鲍曼标准株,Optiprep密度梯度超速离心提取并纯化其omv,经负染电镜检测omv形态;BCA法检测omv总蛋白浓度,SDS-PAGE分析蛋白相对分子质量大小;用纯化的omv和蛋白酶K处理后的omv分别刺激人肺癌上皮细胞A549,同时用设不加omv的A549细胞做对照,酶链免疫吸附(ELISA)法检测炎性因子白细胞介素(IL)-8表达水平。结果鲍曼不动杆菌分泌的omv为10~200nm的球状囊泡结构;其含有的总蛋白浓度为43.2mg/mL;ELISA结果提示,鲍曼不动杆菌分泌的omv可刺激A549细胞产生炎性因子IL-8,且产生水平与omv剂量呈正比。结论纯化的鲍曼不动杆菌的omv为10~200nm的双层囊泡结构,内含多种毒力蛋白,能刺激人肺癌上皮细胞A549产生IL-8。

鸵鸟新城疫的病理形态学观察

通过病理剖检、病理组织学及电镜负染观察等方法对来自山东、河南等地的15只表现典型新城疫症状的发病鸵鸟的死亡原因进行系统研究分析。病理剖检可见发病鸵鸟全身广泛性出血,其中以消化道黏膜出血为主;病理组织学观察可见其病理特征以消化道黏膜出血,细胞变性、坏死、脱落为主,同时伴发心肌纤维和肾小管上皮细胞的颗粒变性,脾脏和肺脏充血、出血以及其头颈部的水肿,淋巴组织的坏死等病理变化。电镜负染观察可见圆形、椭圆形或纺锤形,直径200~500 nm,具有明显纤突的典型副黏病毒粒子。以上试验结果证实鸵鸟的死亡原因为新城疫病毒感染所致。

胆结石与胆汁中纳米细菌的检测与意义

目的研究胆结石患者胆汁及结石中纳米细菌(NB)的感染情况,分析纳米细菌与胆结石形成的关系,探讨纳米细菌在胆结石形成中的可能机制。方法选择2013年10月-2014年12月杭州市西溪医院外科手术患者,术中无菌收集胆汁43例(胆囊结石患者36例,非胆囊结石患者7例),结石30例。采用细胞培养的方法,对胆汁及结石中的纳米细菌进行分离培养。采用间接免疫荧光法、透射电镜负染法、茜素红钙染色法、PCR法等对纳米细菌进行鉴定。结果以间接免疫荧光法为金标准,胆汁中纳米细菌阳性率为44.18%(19/43),其中胆结石患者胆汁纳米细菌阳性率为50.00%(18/36),非胆囊结石患者胆汁中纳米细菌阳性率为14.29%(1/7);结石中纳米细菌阳性率为60.00%。胆囊结石患者胆汁与结石中NB的阳性率无统计学差异。钙染色法与间接免疫荧光法、PCR法与间接免疫荧光法检测纳米细菌无统计学差异。结论纳米细菌与胆结石密切相关。胆结石患者纳米细菌的感染率较高,可能会促进胆结石的形成。采用细胞培养、稀释双过滤的方法能从胆汁及结石中分离培养出纳米细菌;透射电镜负染法、间接免疫荧光法可作为纳米细菌鉴定的金标准,茜素红钙染色、PCR法可作为重要参考。