病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测方法的建立

为建立病毒性出血性败血症病毒精准快速检测方法,以病毒性出血性败血症病毒基因组特异保守的糖蛋白基因片段为靶目标,设计合成了特异性引物及探针,优化退火温度等关键反应条件,分别进行灵敏性试验、特异性试验及重现性试验,构建病毒性出血性败血症病毒数字PCR检测技术体系,同时,与实时荧光定量RT-PCR方法进行对比分析。试验结果显示,病毒性出血性败血症病毒数字PCR最佳退火温度为58.5℃。灵敏性试验显示,随着病毒性出血性败血症病毒基因组RNA连续10倍稀释,稀释至105倍数时,数字PCR体系仍可以检测到阳性微滴,因此,确定RNA基因组核酸含量19拷贝/μL为病毒性出血性败血症病毒数字PCR的检测低限。特异性试验表明,该方法只与目标病毒——病毒性出血性败血症病毒有特异性扩增,与传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、真鲷虹彩病毒、淋巴囊肿病毒等10种病毒均无扩增反应。重复性试验结果表明,病毒性出血性败血症病毒数字PCR批内与批间试验的变异系数均小于1%,具备良好的重复性。利用构建的数字PCR方法,对收集到的国内及进境鱼类样品共计1210批次进行病毒性出血性败血症病毒检测,结果显示,数字PCR阳性样本检出率为9.5%,常规实时荧光定量RT-PCR阳性样本检出率为7.69%~7.77%。临床试验结果表明,研究建立的病毒性出血性败血症病毒数字PCR方法较常规技术具有更高的检测灵敏性,适用于水生动物疫病精准检测的需求。

鲫鱼败血症病的防治研究

鲫鱼败血症病的病原体为嗜水性气单胞菌,发病的主要症状为体内及体表大量充血,脏器发生病变。水质调节困难和底泥淤积是发病的主要原因。清除池底淤泥,改善进排水系统和做好鱼种消毒是防病的根本,发病后,要采取内服与外洒药相结合的治疗方法。

鱼类病毒性出血性败血症病毒基质蛋白的原核表达及其亚细胞定位

为了对鱼类病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)基质蛋白(matrix protein, M)进行功能研究,本实验通过PCR扩增了M基因全长序列,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体效价,并运用Westernblot和间接免疫荧光检测抗体特异性。结果显示,M基因全长为606bp,IPTG诱导得到的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,大小约为36 kD,比预计略小。间接ELISA检测抗体效价大于1:102400,Westernblot检测显示该抗体可以特异性识别纯化的融合蛋白和VHSV感染的鲤上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini, EPC)细胞中的M蛋白。间接免疫荧光结果显示M蛋白多抗能识别感染VHSV的EPC细胞中的M蛋白,且M蛋白主要定位于细胞质和细胞膜。本研究中M蛋白多克隆抗体的制备将有助于开展M蛋白的功能研究及疾病的免疫学诊断。

应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV)

参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化。结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带。巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致。该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA。初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段。

病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体的制备及其特性分析

目的制备抗病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的单克隆抗体(mAb)。方法以差速离心法提纯VHSV作为免疫原,免疫BALB/c小鼠。应用杂交瘤细胞技术进行细胞融合,间接ELISA进行筛选检测,且对mAb进行特性分析。结果制备出1株抗VHSV mAb,命名为4A5。对其进行特性分析结果显示该抗体腹水效价104以上;属于IgG3型,κ链;仅与VHSV本身反应,与其他病毒和细胞均不发生交叉反应;对应的抗原位点在VHSV蛋白的相对分子质量(Mr)70 000的条带处,该蛋白带是VHSV的G蛋白。结论制备出的特异性好的抗VHSV mAb,为该病毒的快速诊断及流行病学监测提供了检测试剂。

病毒性出血性败血症病毒(VHSV)实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

根据VHSV的较为保守的glyG基因,设计了三套LAMP引物,筛选出扩增效率最优的第二套引物VHSV-2,引入其环引物以加快其反应。采用ESE-Quant tube scanner(德国QIAGEN公司)恒温实时荧光反应及检测平台,反应温度为63℃,恒温下30min内可得出结果。同时评价VHSV引物的灵敏度和特异性,灵敏度结果显示其检测限可达到4.5pg每反应,与几种重要的病原RNA均无交叉反应。本文建立的检测VHSV的RT-LAMP检测方法简单、易操作,同时具有较高的灵敏度和特异性。本研究建立的实时荧光RT-LAMP检测方法可作为VHSV的快速诊断工具,适合VHSV的现场快速检测和大规模监控。

病毒性出血性败血症病毒N基因的病毒样颗粒制备及定值

为制备含有病毒性出血性败血症病毒(VHSV)N基因的RNA病毒样颗粒标准样品,通过RT-RCR扩增VHSV的N基因,将其克隆至含有组氨酸标签的pNH-MS_2his载体中,构建重组原核表达载体pNHMS_2his-N;将重组质粒pNH-MS_2his-N转化至表达菌株BL21(DE3),用1 mmol/L IPTG诱导表达、纯化;对病毒样颗粒进行鉴定及稳定性试验,使用数字PCR对病毒样颗粒进行定值。结果显示,该病毒样颗粒含VHSV N基因序列,并且稳定性良好,定值结果为8×10~6 copies/m L。结果表明,构建的病毒样颗粒可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品使用。

鱼类病毒性出血性败血症病毒核蛋白基因的原核表达

通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得编码病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)核蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET28a,并在E.coli BL21(DE3)中得到表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为1 221bp核蛋白基因片段,诱导表达重组质粒pET28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1mmol/L时,诱导5h蛋白表达量最高,获得的目的蛋白大小与N蛋白的预测分子质量一致,约为48ku。诱导后的菌液进行超声波破碎后,将沉淀和上清分别用于SDS-PAGE电泳,结果表明目的蛋白主要以包涵体的形式存在。表达蛋白经过复性、纯化,得到了较高纯度的可溶性蛋白。经Western-blot检测表明,该表达产物能被羊抗VHSV阳性血清特异性识别。

病毒性出血性败血症病毒夹心ELISA检测方法的建立

为建立病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的夹心ELISA方法,本研究以VHSV单克隆抗体(MAb)IP5B11为捕捉抗体,兔抗VHSV多抗为检测抗体,经反应条件优化建立了VHSV夹心ELISA检测方法。结果表明,该方法与几种常见鱼病病毒无交叉反应,具有较好的特异性;该方法组内和组间变异系数平均值分别为0.046和0.064,重复性良好。采用夹心ELISA和RT-PCR同时检测添加VHSV病毒悬液的40份鳗鱼组织匀浆和未添加病毒的40份阴性对照鳗鱼以及5份星斑川鲽模拟组织样品,结果两种方法检测符合率为100%。本研究建立的夹心ELISA方法可以用于出入境鱼类疫病的检测和国内养殖场的疫情监控。

鱼类病毒性出血性败血症病毒诊断胶体金免疫层析方法的建立

为建立一种快速检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,以标记纯化的VHSV G蛋白单克隆抗体(MAb)10A7为捕捉抗体,将纯化的抗VHSV N蛋白的MAb 10EN单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带,经试验条件优化,组装形成胶体金免疫层析试纸条。用本试验研制的胶体金试纸条检测VHSV感染的CHSE细胞培养物。结果显示:在检测线和质控线均呈现红色条带,而健康的CHSE细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的病毒量最低限为10^(4.0) TCID_(50);随机挑取3个不同批次的试纸条,对阳性样品和阴性样品进行重复试验,未发现差异。特异性试验表明,该试纸条与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、牙鲆弹状病毒(HRV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)无交叉反应。将同一批次的试纸条在4℃条件下保存不同时间后进行检测,发现保存6个月的试纸条仍具有良好的稳定性。本试验研发的胶体金诊断试纸条具有良好的特异性、灵敏性和重复性,在快速辅助检测方面具有推广应用价值。

病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定

为制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)单链抗体(single chain variable fragment antibody,ScFv)并鉴定其生物学功能,本研究提取抗VHSV单抗1G5的杂交瘤细胞株总RNA并反转录获得cDNA模板,通过PCR扩增VHSV抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)编码序列,将其拼接成单链抗体Sc Fv基因后插入载体pET28a中,构建原核表达重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明,单链抗体主要以可溶性形式表达,分子量约28 ku,能特异性识别VHSV病毒的G蛋白并对VHSV病毒具有体外中和活性,其对VHSV病毒的G蛋白亲和力(KD)达到1.4×10^(–8) M。单链抗体ScFv的制备为进一步研究VHSV的治疗性抗体、快速诊断试剂奠定了基础。

病毒性出血性败血症病毒液相芯片检测技术的建立

为建立检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV)的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中VHSV的G基因进行序列分析,设计VHSV特异性引物并标记生物素。探针氨基化修饰并与荧光编码微球偶联后与VHSV RT-PCR产物杂交反应,用液相芯片仪器检测荧光信号。结果表明液相芯片检测体系能够正确检出VHSV。病毒核酸的最低检出量为10pg,检测特异性高,说明初步建立了检测VHSV的液相芯片技术,为VHSV的检测提供了新方法。

病毒性出血性败血症病毒焦磷酸测序检测技术的建立

为建立病毒性出血性败血症病毒(VHSV)焦磷酸测序检测技术,本研究通过对VHSV靶基因特异性序列的同源性分析,设计出适合焦磷酸测序特异性扩增和测序的引物,对焦磷酸测序反应体系和反应程序进行优化,建立了VHSV焦磷酸测序检测方法。结果表明,该方法仅对目的病毒基因扩增,而对其它病毒检测为阴性,表明该方法特异性好;该方法最低检出核酸量为82拷贝/μL,灵敏度高。选取国内采集与进口的鱼类样本共计1924批次进行VHSV检测,结果显示,焦磷酸测序检测方法检测结果与常规RT-PCR一致,该方法的特异性和灵敏度可以满足水生动物疫病检测的需要。

200例败血症病原菌分布特征及耐药性分析

目的探究我院200例败血症患者病原菌的种类及构成比,并通过耐药性分析探究主要菌种的耐药率,为败血症的临床诊断与治疗提供理论依据。方法选择2014年2月—2017年2月于武汉大学人民治疗的200例败血症患者,所有患者均进行血液标本采集,通过BD9120全自动血培养仪进行细菌分离培养,观察病原菌种类及构成比等分布特征。采用美国BD全自动微生物鉴定药敏分析系统进行耐药性分析,分别检测革兰阳性菌以及革兰阴性菌主要菌种对一般抗菌药物的耐药性。结果 200例败血症患者的血液标本中总检出病原菌220株,其中革兰阴性菌所占比例最大,共143株(占65.00%);其中排名前4位分别为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌以及阴沟杆菌,所占比例分别为18.18%(40/220)、17.27%(38/220)、6.36%(14/220)、5.45%(12/220)。革兰阳性菌65株(29.55%);其中排名前3位分别为凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌以及肠球菌属,所占比例分别为17.73%(39/220)、5.45%(12/220)、4.55%(10/220)。真菌12株(占5.45%)。革兰阴性菌中大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶检出率为68.42%(26/38)、肺炎克雷伯菌为22.50%(9/40),革兰阳性菌中金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药株比例为25.00%(3/12)、凝固酶阴性葡萄球菌为82.05%(32/39);败血症患者血液内革兰阴性菌、革兰阴性菌主要菌株对常用抗菌药物均表现出不同程度的耐药性,分别对亚胺培南、万古霉素敏感性最高。结论感染败血症患者病原菌以革兰阴性菌为主,其次为革兰阳性菌,真菌感染所占比例极小,耐药性分析分析情况不容乐观,对常用抗菌药物均表现出不同程度的耐药性,临床上需要根据病原菌分布特征及耐药性分析结果使用合理的抗生素治疗,同时要避免抗生素的不规范使用。

病毒性出血性败血症病毒RNA标准物质的研制

利用基因克隆和体外转录技术制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)核酸检测标准物质。设计VHSV N基因的克隆引物,RT-PCR获得相应片段,连接至pGEM-T载体,测序后采用体外转录方法制备RNA纯品。初步定量稀释后,混合分装作为核酸标准物质候选物。采用核酸浓度测定与拷贝数换算的方法对转录的RNA片段进行定值。通过绘制荧光定量标准扩增曲线计算标准物质含量(拷贝数),并根据委托单位的定值结果进行不确定度的估算。均一性结果显示瓶间差异小于5%,稳定性试验表明室温20℃~25℃(相对湿度20%~25%)7 d,2℃~8℃保存1个月及-20℃保存6个月的含量均无明显变化。核酸标准物质定值为(6.625±0.149)×10~8copies/μL,可用作VHSV核酸检测的标准质控品。

家兔病毒性败血症病理学研究

兔出血性败血症又名'兔瘟',是家兔中传播迅猛的病毒性传染病。我们曾从省内z0个疫区县采集病料28份,通过动物接种、血凝抑制试验、免疫电镜观察及交叉免疫试验确诊本病。为了总结我省兔病毒性败血症病理损害特点、诊断依据并探讨其发病机理,我们对40例人工及自然病例尸体进行了系统的肉眼、光镜及电镜研究。 1

aEEG及NCIS预测早产儿败血症相关性脑病的比较

目的 比较振幅整合脑电图(aEEG)及新生儿危重病例评分(NCIS)预测早产儿败血症相关性脑病(SAE)的诊断价值。方法 选择2020年9月至2022年10月南京医科大学附属妇产医院新生儿重症监护病房(NICU)收治且病情最严重期间进行了aEEG监测的败血症早产儿为研究对象,根据SAE诊断标准,将47例败血症早产儿分为SAE组24例和非SAE组23例。两组败血症早产儿aEEG检查同时进行NCIS,比较两组患儿的一般资料、母孕期并发症、最差血气分析及aEEG监测时一般情况、疾病危重状况的差异,以及aEEG各参数的连续性、周期性、下边界振幅、带宽及总分和校正总分的差异。绘制SAE受试者工作特征(ROC)曲线,计算灵敏度、特异度和曲线下面积(AUC)。根据约登指数,比较NCIS和aEEG预测SAE的诊断价值。结果 两组败血症早产儿的一般资料、母孕期并发症、最差血气分析,及aEEG检查时的一般情况间的差异均无统计学意义(^(均)P>0.05),而NCIS、aEEG的连续性、周期性、下边界振幅、带宽、总分,均有统计学差异(^(均)P<0.05)。NCIS、aEEG的连续性、周期性、下边界振幅、带宽、aEEG总分,诊断SAE的AUC分别:0.727、0.726、0.884、0.706、0.849、0.890,约登指数分别0.406、0.703、0.703、0.412、0.746、0.701。结论 NCIS、aEEG连续性、周期性、带宽、总分,对诊断SAE有早期预测价值,aEEG比NCIS预测SAE效能更佳。

病毒性出血性败血症病毒(VHSV)可视化核酸试纸条检测方法的建立

本研究通过在病毒性出血性败血症病毒(Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus,VHSV)的保守区5’端设计一对保守引物,在上游和下游引物的5’端分别修饰生物素(biotin)和异硫氰酸荧光素(FITC),成功建立了VHSV快速、可视化核酸试纸条检测方法。该方法具有高灵敏度,能够检测到33拷贝/μL的VHSV,比凝胶成像检测方法提高了10倍的灵敏度。实验结果证实该方法操作程序简便、反应迅速且灵敏,具备良好的特异性,可满足现场一线对于VHSV快速检测的需求,为流行病学调查及预防控制提供了新的方法学基础。

荧光环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)技术在病毒性出血性败血症(VHS)诊断中的应用

运用GenieII实时荧光等温扩增检测系统,以LAMP法荧光检测为基础,建立了对病毒性出血性败血症病毒进行荧光实时反转录环介导等温扩增检测方法。根据对VHSV病毒N基因序列的分析,针对病毒的高保守区域的6个特异性序列,设计了3对特异性引物,同时加入dsDNA混合染料,对核酸扩增过程进行实时荧光监控。该方法的特异性良好,与其他鱼类弹状病毒无交叉反应。敏感度高,检测限为20fgRNA模板。实验结果表明该方法是一种操作简单、快速高效、高特异性高灵敏度的病毒检测方法。

病毒性出血败血症病毒实时荧光RT-RPA恒温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的病毒性出血败血症病毒(VHSV)检测方法,本研究通过比较分析VHSV N基因的保守序列,设计了多对引物和一条探针。经过筛选优化,建立了实时荧光RT-RPA检测方法。该方法在39℃恒温反应20 min即可快速、特异性地检测出VHSV,与其他水生动物病毒不发生交叉反应,该方法检测限为1.83×10^3PFU/mL,利用本研究方法对30份鲑鳟鱼临床样品以及9份鱼类疫病病原样品进行检测,检测结果与荧光定量PCR方法结果一致。上述结果表明,本研究建立的检测方法操作简单,反应灵敏,结果可靠,仪器依赖性低,适用于现场对VHSV快速检测。