质粒介导的AmpC β-内酰胺酶共有抗原表位的预测及原核表达

目的:应用生物信息学方法预测质粒介导的AmpC β-内酰胺酶(pAmpCs)共有抗原表位,并实现pAmpCs共有抗原表位-Trx融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定。方法运用多序列比较工具找出各型质粒介导的AmpC β-内酰胺酶的共有相对保守区域,并利用分子生物学软件Biosun预测各亚型pAmpCs的可及性、抗原性、抗原表位、柔性、亲水性等参数,通过综合分析后找出其共有的抗原表位区域pAmpCs1。根据大肠杆菌的密码子偏好性,把氨基酸序列pAmpCs1转变为核苷酸序列pampcs1,采用重叠延伸PCR合成pampcs1片断,并构建原核表达载体pET32a(+)/pampcs1。通过测序验证,对含有该重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析后,用Ni-NTA亲和层析法纯化pAmpCs1-Trx融合蛋白,利用Western blot方法鉴定融合蛋白的抗原性。结果:根据预测结果找到了一段各型pAmpCs共有的抗原表位区域pAmpCs1,成功构建了原核表达载体pET32a(+)/pampcs1,经IPTG诱导后得到了分子量约为23kDa的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,通过Western blot鉴定该蛋白能被抗AmpC β-lactamases多抗识别。结论:成功构建了pAmpCs1-Trx融合蛋白原核表达载体,并获得了高纯度的pAmpCs1-Trx融合蛋白,初步证明它的抗原性,为制备特异性抗体及建立快速检测方法打下了良好的基础。

头孢吡肟对质粒介导产AmpC β-内酰胺酶大肠埃希菌的接种效应研究

目的本实验研究了临床分离的质粒介导AmpC β-内酰胺酶大肠埃希菌,在两种接种浓度下(标准浓度105CFU/ml和高浓度107CFU/ml)测定头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦和亚胺培南的MIC值。方法19株血培养的质粒介导的AmpC β-内酰胺酶大肠埃希菌,其中10株单产ACT型,5株单产DHA型,4株产ACT+DHA型。采用琼脂稀释法测定头孢吡肟等5种抗生素在两种接种浓度下的MIC值。高接种浓度下测得的MIC值较标准接种浓度下的MIC值≥8倍时定义为有接种效应。结果在标准接种浓度下,亚胺培南的敏感率为100%,头孢吡肟也有84.2%的高敏感率,头孢哌酮/舒巴坦的敏感率为5.3%,头孢噻肟和头孢他啶的敏感率为0。在两种接种浓度下,头孢吡肟MIC值增加从32倍到100多倍不等,100%有接种效应,而亚胺培南几乎没有接种效应。结论头孢吡肟有明显的接种效应,尽管本文结果为实验室的体外实验结果,但仍建议:头孢吡肟不推荐为临床上治疗由质粒介导AmpC β-内酰胺酶大肠埃希菌引起的严重感染的药物。