马铃薯青枯菌Po82菌株质粒基因组分泌蛋白信号肽的分析

应用计算机技术和生物信息学的方法,采用Signal P4.0、Lipo P1.0、Target P1.0.1、TMHMM2.0蛋白质分析软件对植物病原细菌Ralstonia solanacearum Po82质粒基因组的1680个ORFs编码的分泌蛋白信号肽氨基酸序列进行预测分析。结果表明,质粒基因组的1680个ORFs中有102个ORFs所编码的蛋白质具有N-端信号肽序列,包括85个Ⅰ型信号肽,1个Ⅱ型信号肽,15个Prepilin-like信号肽和1个细菌素和信息素信号肽,所有的分泌蛋白中具有RR-motif信号肽结构的有14个,且均为Ⅰ型信号肽。在102个具有可切割信号肽的分泌蛋白中,有50.98%的蛋白质为胞外分泌型(S型),33.33%为线粒体分泌型(M型),6.87%为叶绿体分泌型(C型),8.82%为其他类型的分泌蛋白。信号肽切割位点的氨基酸组成中非极性氨基酸为53.27%,极性氨基酸为18.79%,带负电荷的酸性氨基酸为19.12%,带正电荷的碱性氨基酸为8.82%。比较R.solanacearum GMI1000和R.solanacearum Po82质粒基因组信号肽类型的区别,发现这2种菌在信号肽类型上存在很大差异。文章通过对R.solanacearum Po82质粒基因组信号肽分泌蛋白的研究,揭示了该病原菌与寄主互作的致病机制在长期进化中的独特地位。

Ti质粒基因在单子叶植物石蒜和金针菜中的表达

本文报道了用胭脂碱型致瘤农杆菌感染单子叶植物石蒜和金针菜的实验结果。石蒜和金针菜的花茎幼嫩部位被致瘤农杆菌A_(208)感染后,一个月内形成小瘤。纸电泳结果表明,所有瘤组织都含有胭脂碱,证明石蒜和金针菜的细胞可被转化并表达nos基因;本文讨论了致瘤农杆菌转化单子叶植物的范围和筛选方法。

Solexa测序法研究肺炎克雷伯菌质粒基因组的耐药基因

目的通过Solexa高通量测序法研究肺炎克雷伯菌的质粒与耐药性的关系。方法菌株为7年临床分离的206株肺炎克雷伯菌。提取所有菌的全部质粒DNA，Solexa高通量测序获得大规模的短序列。SOAP软件对质粒基因进行分析拼接，分析结果与相关数据库进行比对。MAQ软件分析质粒基因组包含的超广谱β-内酰胺酶（ESBL）多样性及单核苷酸多态性（SNP）情况。结果肺炎克雷伯菌质粒基因组中已知的直接与耐药相关的基因就有13种。质粒基因组中存在多个ABC主动外排转运系统。发现4种编码β-内酰胺酶的ORF，其中SHV型ESBLs分布最广。系统分析了206株肺炎克雷伯菌质粒基因组中SHV型ESBLs的SNPs位点，发现存在着大量的非同义替换SNPs位点。结论发现质粒中SHV型ESBLs基因可能受到选择压力，存在着大量的非同义替换SNPs位点。肺炎克雷伯菌质粒存在外排药物耐药方式，从而形成低水平的非特异多重耐药。

南京地区1999—2006年淋球菌青霉素耐药性及耐药质粒基因型研究

目的了解南京地区淋球菌青霉素耐药状况及产青霉素酶淋球菌的质粒基因型的流行情况。方法采用琼脂稀释法检测淋球菌对青霉素的最小抑菌浓度采用纸片酸度定量法检测菌株是否产青霉素酶。采用单管PCR方法对产青霉素酶淋球菌耐药质粒进行基因分型。结果8年间共检测1208株淋球菌，青霉素总耐药率为84．02％（1015／1208）。非产青霉素酶淋球菌中，染色体介导的耐青霉素淋球菌占74．02％（550/743）。产青霉素酶淋球菌占38．49％（465／1208），其中177（38．06％）株同时为质粒介导的耐四环素淋球菌即质粒介导的高度耐四环素淋球菌。产青霉素酶淋球菌阳性率自1999（8．04％）年起逐年增加，至2004年达最高（57．36％），2005、2006年略有下降。质粒PCR分型显示，所测菌株均携带亚洲型质粒。结论南京地区耐青霉素淋球菌始终维持在较高水平，产青霉素酶淋球菌近年增加较快，携带亚洲型质粒的产青霉素酶淋球菌在南京地区流行，未发现其他类型的质粒。

马铃薯青枯病(Ralstonia solanacearum)质粒基因组分泌蛋白信号肽初步分析

应用SignalP 3.0,TMHMM 2.0,THUMBUP,big-PI,TargetP 1.01,Lipop 1.0,TatP 1.0等7种软件分别对马铃薯青枯病菌Ralstonia solanacearum GMI1000质粒基因组1 681个氨基酸序列进行预测分析.结果表明,该物种质粒基因组分泌蛋白有85个,占其基因组编码蛋白的5.1%.通过对质粒分泌蛋白切割位点信号肽类型分析后发现具Ⅰ型信号肽的分泌蛋白有73个,Ⅱ型的有12个,所有分泌蛋白中具RR-motif信号肽结构的有3个,且均为Ⅰ型信号肽.质粒分泌蛋白中,59个具可预测功能,26个为未知功能蛋白.已知功能的分泌蛋白主要集中于细胞代谢,细胞调控及转运,细胞膜结构等领域.在质粒分泌蛋白中发现3个Ⅲ型信号肽分泌蛋白,该类蛋白是由hip基因编码产生,在植物及动物病原细菌中相当保守,负责将效应蛋白分子转运到寄主细胞中从而产生致病作用.这些功能是该物种在长期进化过程中与环境中各种因子发生互作,相互适应的结果.

仔猪骨骼肌注射pGRF基因质粒的促生长及代谢调控效应研究

给体重约 5 0kg的长白×太湖仔猪以 0 2 5、0 5、1 0、2 0mg剂量半腱肌部位注射 pGRF基因的表达质粒 ,5～ 10kg阶段终体重分别比 0mg组增加 4%、17%、2 0 %和 16 % ,日增重增加 8%、37%、43%和 36 % ,采食量提高 17%、2 7%、2 3 %和 11% ;耗料增重比 ,0 5mg组、1 0mg组及 2 0mg组分别比 0mg组降低 8%、14%和 18%。1 0mgpGRF基因质粒使血液中生长激素释放因子 (GRF)比对照组升高 1 6倍 (P <0 0 5 )、生长激素 (GH)升高2 5倍 (P <0 0 1)、类胰岛素生长因子 (IGF Ⅰ )升高 2 3倍 (P <0 0 1) ,血液中尿素浓度降低 2 0 % (P <0 0 5 ) ,血液中甘油三酯浓度 (TG)明显下降 (P <0 0 5 )。试验研究还证明生长抑素 (SS)分泌的增加是限制 pGRF基因质粒高用量时正效应发挥的重要因素 ,1mg为 5～ 10kg阶段仔猪注射 pGRF基因质粒的适宜剂量。

生长肥育猪骨骼肌注射表达pGRF基因质粒的效应研究

将猪的GRF基因表达质粒注射于猪的骨骼肌后,研究其促生长效应与机理。选用始重6.3kg的44头去势长白×太湖仔猪,分6组,采用2×3因子安排的完全随机区组设计,按6～10kg、10～20kg、20～50kg、50～100kg4个阶段饲养。4个饲养阶段的饲粮低蛋白水平分别是20.70%,17.90%,15.03%,13.00%;高蛋白水平分别是23.70%,20.90%,18.02%,16.00%。pGRF基因质粒注射剂量设0mg、0.5mg、1.0mg3个水平,于试验开始与试验猪体重达60kg时共注射基因质粒2次。测定各阶段日增重,饲料消耗量,耗料增重比以及30、70、100kg时血液中GH、GRF、IGF-I的浓度。100kg时屠宰进行胴体品质测定。结果表明:饲粮蛋白水平对各阶段及全期试验猪日增重均有显著影响(P<0.05或P<0.01),对50～100kg阶段与全期日采食量和耗料增重比有显著影响(P<0.05或P<0.01)。注射pGRF基因质粒对各阶段及全期日增重均有显著影响(P<0.05),对6～10kg、10～20kg、50～100kg3阶段及全期日采食量有显著影响(P<0.05),对6～10kg阶段、50～100kg阶段及全期耗料增重比有显著影响(P<0.05)。注射pGRF基因质粒对30kg及70kg体重时猪血液中GRF、GH、IGF-I浓度均有显著影响(P<0.05)。提高饲粮蛋白水平与注射pGRF基因质粒均可明显降低超声波测膘厚及屠宰测膘厚、增大眼肌面积(P<0.05)。

氟喹诺酮耐药志贺菌中质粒介导qnr基因的检测

目的检测志贺菌对氟喹诺酮抗菌药物的耐药情况,探讨氟喹诺酮耐药与志贺菌携带质粒介导qnr基因的关系。方法用纸片扩散法对100株志贺菌(福氏志贺菌50株,宋内志贺菌50株)进行耐药性检测,聚合酶链反应(PCR)检测志贺菌质粒介导qnr基因并进行DNA测序,分析qnr基因的存在与药敏结果的关系。结果 100株志贺菌中有9株检出qnr基因,检出率为9%(9/100),福氏志贺菌为4%(2/50),宋内志贺菌为14%(7/50);qnr基因阳性菌株对氧氟沙星的耐药率(11.1%)高于阴性菌株(5.5%),但差异无统计学意义。qnr基因阳性菌株对5种氟喹诺酮药物的抑菌圈中位数比较均缩小。结论宋内志贺菌质粒介导氟喹诺酮耐药qnr基因的携带率明显高于福氏志贺菌;志贺菌若携带质粒介导qnr基因则会导致对氟喹诺酮药物的敏感性下降。

狂犬病病毒口服疫苗株SRV9全长基因质粒的构建

狂犬病病毒(Rabies Virus)是一种致死性的人畜共患病。为了深入研究狂犬病病毒的基因组特性及构建新型病毒载体,研究根据GenBank中已公布的狂犬病病毒口服疫苗株SRV9(登录号:AF499686)基因组序列设计数对引物,以SRV9病毒为材料,通过RT-PCR技术将总RNA中SRV9全长基因组11,928 bp分5段扩增,分别克隆到pMD18-T或pGEM-T载体测序鉴定。测序正确后,再克隆至pBluescript skⅡ(+)载体,利用扩增片段自身内切酶切位点顺次进行全长连接,获得含SRV9全长基因组的质粒pBLSRV9。通过基因组序列同源性比较分析,SRV9株具有稳定的遗传特性,为进一步探索狂犬病病毒的复制、感染、致病及免疫分子机制和研制新型狂犬病病毒疫苗奠定良好的基础。

鸡甲状旁腺素基因质粒对蛋鸡蛋壳质量和激素水平的调控研究

试验选用56周龄新扬州鸡产蛋期母鸡150只,随机分为3组,每组5个重复,每个重复10只;腿肌注射0、200、400μg鸡甲状旁腺素基因质粒(pCEP4-PTH),研究其对蛋鸡生产性能、蛋壳质量和血液部分激素的影响.试验结果表明,pCEP4-PTH基因质粒可改善蛋鸡生产性能;200μg注射量可显著改善蛋壳强度(P<0.05),400μg注射量对蛋壳质量影响不显著;pCEP4-PTH基因质粒可显著提高蛋鸡体内甲状旁腺素(PTH)水平(P<0.05),且注射400μg时达到极显著水平(P<0.01);注射400μg pCEP4-PTH基因质粒具有促进内源降钙素(CT)和雌激素(E2)分泌的作用(P<0.05),因而不利于PTH生物学效应的发挥;两试验组骨钙素(BGP)与对照组差异不显著,提示生产性能和蛋壳质量的改善未对骨骼发育造成不良影响.说明pCEP4-PTH基因质粒可改善蛋鸡生产性能和蛋壳质量,且不影响骨骼质量.

银耳孢子发酵物及与pGRF基因质粒合用对断奶仔猪生长、部分免疫指标及肠道菌群的影响

本研究探讨了银耳孢子发酵物(TSF)及与猪生长激素释放因子(pGRF)基因质粒合用对断奶仔猪生长、部分免疫指标以及肠道菌群的影响,同时与饲用抗生素效果作比较。选用48头(28±2)日龄的断奶D×L×Y三元杂交仔猪,采用单项分类试验设计,按体重相近、性别一致的原则随机分到对照组、抗生素组(吉他霉素40 mg/kg+硫酸抗敌素20 mg/kg)、TSF(4 000 mg/kg)组和TSF(4 000 mg/kg)+pGRF组4个组中,TSF+pGRF组中pGRF基因质粒是在试验开始时于每头猪后腿肌肉注射1 mg。试验期28 d。结果表明:与对照组相比,3组均显著提高了断奶仔猪的日增重(P<0.05)及改善饲料转化效率(P<0.05)。添加有TSF的2组较对照组和抗生素组能显著提高血清IL-2浓度(P<0.05)、T淋巴细胞转化率(P<0.05)和血清猪瘟抗体滴度(P<0.05);T淋巴细胞数量也有明显的提高(P=0.10)。添加有TSF的2组乳酸杆菌和双歧杆菌均显著高于抗生素组(P<0.05),与对照组差异不显著(P=0.07)。由结果证明,TSF有促生长的作用,而且效果与吉他霉素+硫酸抗敌素相当;同时TSF还能提高断奶仔猪的免疫功能,优化肠道菌群;TSF与pGRF基因质粒合用有进一步提高生长性能的趋势,但对免疫功能和肠道菌群没有进一步的改善作用。

pGRF基因质粒对免疫应激断奶仔猪生长抑制的缓解作用

旨在研究pGRF基因质粒对免疫应激断奶仔猪生长的影响,探讨pGRF基因质粒缓解免疫应激引起的生长抑制作用及其可能的机理。选取18头日龄为(35±2)d、体质量为(7.86±0.59)kg未去势的杜洛克×长白×大白(DLY)三元杂交断奶仔猪,采用单向分类试验设计,按体质量相近、性别一致的原则配对,分为3个处理,即pGRF(pGRF基因质粒)组、pGRF+LPS(脂多糖)组和LPS组,每个处理6个重复,每个重复1头猪。结果表明:pGRF基因质粒可以缓解因注射LPS导致的日增质量的降低(P<0.05),饲料转化率有所改善(P>0.05);能够抑制由LPS诱导的细胞因子(IL-1I、L-6)浓度的上升(P<0.05或P<0.01)和血清IGF-I浓度的降低(P<0.05或P<0.01),同时显著提高血清IgG的浓度(P<0.05)。结论:pGRF基因质粒缓解了断奶仔猪因注射脂多糖引起的生长抑制,降低了血清IL-1和IL-6的水平,提高了血清IgG的浓度,提高了仔猪的抗病力,从而缓解了断奶仔猪的免疫应激;pGRF基因质粒缓解免疫应激的作用与其促进IGF-I的分泌密切相关。

导入外源GRF基因质粒对犊牛生长性能的影响

为了研究导入GRF基因质粒对犊牛生长性能的影响,选取36头体重为约102kg西门塔尔杂交牛,随机分成四组每组9头,分别注射含有0mg,3.37mg,6.74mg,10.11mg质粒的5ml生理盐水。在试验过程中,定期进行增重,饲料采食量和生长激素水平的测定。试验结果表明,各处理组均在一定程度上提高了动物的日增重和饲料转化率,其中6.74mg处理组效果最好,日增重比对照组高出17.33%(P<0.01),饲料转化率提高18.05%(P<0.01)。屠宰后进行组织质粒残留检测,未发现有残留。

人肝细胞生长因子基因表达质粒的构建及其活性研究

目的 :构建一种携带人肝细胞生长因子 (HGF)基因的表达质粒 (pUDKH) ,并对其体外活性进行研究 ,为其体内应用提供依据。方法 :从人胎盘cDNA文库用PCR方法克隆人HGF基因 ,并将其克隆至自行构建的真核表达载体 pUDK上 ,获得表达质粒 pUDKH。将pUDKH体外转染原代培养的骨骼肌细胞 ,分析其转染效率及表达上清中HGF、血管内皮生长因子 (VEGF)的表达水平 ,并采用MTT法分析不同剂量HGF表达产物对人脐静脉内皮细胞的作用。结果 :所克隆构建的携带人HGF基因的质粒 pUDKH可有效转染原代培养的骨骼肌细胞 (0 .0 5 7% ) ,并表达HGF(16～ 18ng/ 4× 10 5cells)和VEGF ,其表达产物对人脐静脉内皮细胞具有明显的增殖刺激活性 (P <0 .0 5 ) ,而且有剂量效应关系。结论 :初步证实本研究构建的质粒

鼠伤寒沙门菌质粒毒力基因对耐药表型的影响

目的:探讨沙门菌质粒毒力基因(spv)表达改变对鼠伤寒沙门菌耐药表型的影响。方法:在e GFP基因序列上下游增加启动子及终止子并在两端位点上、下游设计酶切位点,以p ACYC184-e GFP为载体,构建spv基因回补质粒,电转化至前期构建的鼠伤寒沙门菌spv B及spv C基因共同缺陷株获得基因回补株,检测菌株间耐药性的差异及acr AB表达的差异。结果:成功构建鼠伤寒沙门菌spv B、spv C基因荧光回补株,连续培养12代质粒未发生丢失。与野生型菌株及回补株相比,spv基因缺陷变异株对哌拉西林他唑巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、四环素、氯霉素及环丙沙星的MIC值下降。spv基因缺陷变异株Acr A周质蛋白水平低于野生菌株及回补株(P<0.05)。结论:在spv B及spv C基因共同缺陷鼠伤寒沙门菌基础上的基因回补株构建成功,spv下调能改变鼠伤寒沙门菌的耐药表型,这可能是通过影响外排泵Acr A来完成的。

肌肉注射高剂量pGRF基因质粒对猪生产性能及血液激素水平影响的研究

为探讨高剂量注射pGRF基因质粒对动物生产性能及血液激素水平的影响,本试验选取平均体重为(6．78± 0．47)kg的断奶仔猪24头,随机分为3个处理,每个处理4个重复。在试验开始时按不同处理分别注射0、2．2 mg和 4．4mg的pGRF基因质粒。结果表明:注射2．2 mg和4．4 mg的pGRF基因质粒对动物的生产性能具有一定的改善作用(P<0．05或P>0．05),注射高剂量(4．4 mg)pGRF基因质粒相对于2．2 mg剂量并不能进一步改善动物的生产性能。高剂量(4．4 mg)pGRF基因质粒可相对延长其在动物体内的作用时间,可有效提高动物生长后期血浆GRF浓度。高剂量(4．4 mg)的pGRF基因质粒具有促进内源生长抑素(SS)分泌的作用,因而不利于其生物学效应的发挥。

口蹄疫病毒多基因重组质粒的体外表达及衣壳组装

PCR扩增获得包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分2B编码区的目的基因片段P12X3C3D,将P12X3C3D经AflⅡ和XbaI双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1(+);另将PCR扩增获得的P12X3C3D直接与真核表达质粒载体pTARGETTM连接,进行筛选、鉴定及DNA序列分析,分别获得重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D。将重组质粒分别转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原,用磷钨酸负染,以电子显微镜观察转染重组质粒的细胞中组装的口蹄疫病毒空衣壳。结果表明,口蹄疫病毒基因组片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C3D、pTARGET/P12X3C3D均可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。其中重组质粒pTARGET/P12X3C3D表达的口蹄疫病毒抗原蛋白,能够在细胞内正确组装成病毒空衣壳。

鸡甲状旁腺素基因质粒对蛋鸡生产性能、蛋壳质量及血液激素水平的影响(英文)

试验选用56周龄新扬州鸡产蛋鸡150只,随机分为3个处理,每个处理5个重复,各重复10只。研究经腿肌注射0、200和400μg鸡甲状旁腺素基因质粒(pCEP4-PTH)对蛋鸡生产性能、蛋壳质量和血液部分激素的影响。试验结果表明,pCEP4-PTH基因质粒可改善蛋鸡生产性能;200μg注射量可显著改善蛋壳强度(P<0.05),400μg注射量对蛋壳质量影响不显著;pCEP4-PTH基因质粒可在蛋鸡体内良好表达,甲状旁腺素(PTH)水平均显著升高(P<0.05),且注射400μg时达到极显著水平(P<0.01),注射400μg pCEP4-PTH基因质粒具有促进内源降钙素(CT)和雌激素(E2)分泌的作用(P<0.05),因而不利于其生物学效应的发挥,两试验组骨钙素(BGP)与对照组差异不显著,提示生产性能和蛋壳质量的改善未对骨骼造成不良影响。pCEP4-PTH基因质粒可改善蛋鸡生产性能和蛋壳质量,且不影响骨骼质量。

给猪注射pGRF基因质粒安全性的研究

将56头35日龄断奶DLY仔猪,随机分为4个处理,每个处理2个重复,每个重复7头猪。4个处理分别为对照组、3 mg组(第1天注射3 mg pGRF)、6 mg组(第1、45天分别注射3 mg pGRF)、9 mg组(第1天注射3 mgGRF、第45天注射6 mg pGRF)。到150 d时结束饲养试验,每个处理选择8头猪进行放血屠宰。屠宰前采试猪的全血10 mL制备血浆,分别测定血浆GH、SS和GRF的含量;屠宰后取心、肝、脾、肺和肾各一块用于制作组织切片;另取心、肝、脾、肺、肾、注射质粒部位肌肉和非注射部位肌肉各一块用于检测质粒的残留。结果表明:屠宰前各处理血浆激素的浓度没有显著差异(P>0.05),注射3 mg和6 mg使猪肝脏的器官系数显著下降(P<0.05),对其他器官和功能没有产生不良影响;注射9 mg使肝脏和肾脏产生广泛的颗粒变性。质粒的残留仅在9 mg组注射部位肌肉中能检测到。综合各项试验结果6 mg以下注射剂量的pGRF基因质粒在养猪生产上的使用是安全的。

大肠杆菌VT噬菌体受体基因重组质粒的构建

取含有卡那霉素抗性 ( Kan R)基因的自杀性质粒 p JP56 0 3和含 vpr全长基因的 p U C19phiΦRID质粒 ,分别采用粘性末端及平末端两种连接法。 2种质粒 H inc 单酶切后进行平末端连接 ,经鉴定未得到重组质粒。p JP56 0 3用 H inc 和X ma I消化 ,回收 3kb的载体质粒 ,p U C19Φ RID用 H inc 和 Age 消化 ,回收 778bp vpr目的基因。通过粘性末端连接 ,转化到感受态细菌 CC118λpir,利用 Kan R进行筛选 ,获得的克隆经 Acc 酶切鉴定和 PCR检测 ,确定得到重组质粒 ,即p YYvpr。将重组质粒的 DNA转化到含有全长 vpr基因的感受态细胞 MC10 6 1,筛选到的克隆经 PCR检测 ,得到一株克隆既扩增出 vpr基因 ,又扩增出 Kan R基因 ,初步鉴定该克隆为 MC10 6 1的 vpr同源基因突变株 ,暂定名为 MC10 6 1△ vpr。从而为研究