小鼠PPARδ基因表达载体pCMV-PPARδ的转化扩增

取含鼠过氧化物酶体增殖物激活受体δ(mPPARδ)基因载体pCMV-PPARδ质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含卡那霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选,对挑取的阳性克隆进行LB液体培养基培养。结果转化的DH5α菌在含卡那霉素的琼脂平板上呈克隆样生长,经LB液体培养基培养后提取的pCMV-PPARδ质粒其A260/A280=1.88,浓度为560 ng/μl。提示本研究成功转化并扩增了pCMV-PPARδ质粒,为PPARδ的相关研究提供了高纯度、高浓度的表达载体。

小鼠PPARγ2基因表达载体pcDNA3-PPARγ2的转化扩增

目的对含小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(mPPARγ2)基因载体pcDNA3-PPARγ2进行体外转化和扩增,为基于PPARγ2的相关研究提供高纯度、高丰度的表达载体。方法取pcDNA3-PPARγ2质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养,挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒,紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果经转化后获得了大量抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的pcDNA3-PPARγ2质粒其A260/A280=1.89,浓度为420 ng/μl。结论成功转化并扩增了pcDNA3-PPARγ2质粒,为PPARγ的相关研究提供了高纯度、高浓度的表达载体。

农杆菌质粒DNA高效提取方法研究

以EHA105菌株为实验材料,通过优化质粒扩增条件、加大菌液使用量、改良提取纯化过程中所用试剂等,简化了操作流程,给出了一种高效提取农杆菌中质粒DNA的方法。结果表明,选择LB+KANA为培养基、抗生素质量浓度为50 mg/L,细菌培养至OD600=0.634～0.714时,以5 mL/次用量取菌液裂解;以改进方法提取试剂,得率与常规方法相当。该方法在满足PCR检测条件的前提下既减少了酚、氯仿等有毒试剂的用量,又省时、经济、方便,为植物转基因工程中目的物DNA的检测提供了技术支持。

IGF-1基因克隆及其产物的测序鉴定

基因过表达在基础实验和基因治疗应用中都是常用的手段,而质粒的扩增在基因过表达过程中是不可或缺的技术,如何规范、高效地对质粒进行扩增和提取是基因治疗应用的前提,也是困扰很多基础研究人员的难题。利用现有的实验技术,在降低实验成本基础上,建立过表达质粒扩增、提取的最优方案。首先采用传统方法制作LB培养基和感受态细胞,对转化后的质粒进行大量扩增培养,之后使用商业试剂盒对质粒进行提取,反复试验后对商业试剂盒质粒提取过程进行优化,提高效率,最终获得高纯度和浓度的质粒溶液。经超微量分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测和sanger测序等多种方式检测验证后与NCBI数据库中目标基因序列一致,提示扩增、提取成功。经优化后的质粒扩增、提取方案标准、高效,成本低廉,是质粒基因克隆的最佳选择。

三种癌基因片段的提取

将载有v—fos、c—sis和c—myc的PBR322转化HB101,并在LB培养基中扩增。用碱变性法提取质粒,透析袋法纯化v—fos、c—sis和c—myc基因片段。

野生型大鼠Rab5a基因表达载体pcDNA3-Rab5(a)WT的转化扩增及鉴定

目的对含野生型大鼠Rab5a基因载体pcDNA3-Rab5(a)WT进行体外转化、扩增及鉴定,为基于Rab5a的相关研究提供高纯度、高丰度的表达载体。方法取pcDNA3-Rab5(a)WT质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选,对挑取的阳性克隆进行LB液体培养基培养后抽提质粒,用超微量核酸蛋白测定仪测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定。结果经转化后获得了大量抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的pcDNA3-Rab5(a)WT质粒均为浓度高、纯度高、超螺旋结构为主的质粒。pcDNA3-Rab5(a)WT经PCR后得到Rab5a基因。结论成功转化并扩增了pcDNA3-Rab5(a)WT,为Rab5的相关研究提供了高质量的表达载体。

通过原位易错PCR一步构建基因突变文库

主要介绍一种通过原位易错PCR构建随机突变文库的新技术。本实验室最近发表的一项国际专利中,利用来源于海栖热孢菌的极耐热性DNA连接酶,在传统PCR循环中加入一个连接步骤,即变性—退火—延伸—连接的四步循环法PCR,从而实现环状质粒的PCR指数扩增(PPCP)。原位易错PCR中所用引物为一段线性双链DNA,它含有与模板质粒不同的筛选标记,产物转化宿主菌后,模板质粒在筛选平板上被直接剔除。筛选到的阳性突变子可用作模板直接进入突变文库的再次构建,通过筛选获得二级或多级累加的正突变。利用这种方法构建了一个木聚糖酶基因和一个纤维素酶基因的随机突变文库,并筛选出具有正向突变的蛋白,证明以PPCP为基础的原位易错PCR技术,为基因定向进化提供了一种快速有效的随机突变文库构建的新方法。

利用PTVA法提高超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达

为得到高表达超氧化物歧化酶毕赤酵母工程菌株,促进SOD的产业化生产,将来源于蜡样芽孢杆菌M22菌株的Mn-SOD-2基因转入毕赤酵母GS115中,构建了表达工程菌株YS 1～100。采用PTVA法(Posttransformational vector amplification)进行拷贝数扩增处理。建立了SOD重组菌株MMH(Minimal Methanol+Histidine)平板简易检测法,使用该法对转化子进行初筛,并用荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR)法检测部分重组酵母工程菌中外源SOD基因的拷贝数。结果表明:试验中得到80株高抗Zeocin的菌株YSP 1～80,经MMH平板法筛选得到菌株YSP14、YSP30、YSP48和YSP54的SOD酶活性明显高于处理前;菌株YSP54的SOD基因的拷贝数达到8个拷贝,而处理前仅为1个拷贝;Native-Page分析与NBT酶活性测定显示菌株YSP54发酵上清液中的SOD酶活性达到150U/mL,为处理前的2倍。提高毕赤酵母中外源SOD基因的拷贝数可以相应提高SOD的酶活。