实时定量PCR测定治疗性HBV DNA疫苗工程菌的质粒拷贝数

目的 比较不同的定量方法和总DNA制备方法对实时定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)测定治疗性HBV DNA疫苗工程菌的质粒拷贝数(plasmid copy number, PCN)的影响,为建立快速简便的治疗性HBV DNA疫苗工程菌的PCN测定方法提供参考。方法 通过试剂盒提取法、Triton X-100煮沸法和培养基煮沸法分别制备总DNA样品用于qPCR检测,使用绝对定量方法和相对定量方法计算不同制备方法样品的PCN,并对测定结果进行统计学分析。结果 试剂盒提取法制备的样品经绝对定量和相对定量计算PCN,结果分别为43.10±4.02和42.92±3.98,显著低于Triton X-100煮沸法的结果(69.32±6.51和68.58±6.42)以及培养基煮沸法的结果(75.73±7.46和76.15±7.50)。任一样品制备方法,比较其绝对定量和相对定量结果,差异均无统计学意义。结论 qPCR的绝对定量和相对定量计算方法都适用于治疗性HBV DNA疫苗工程菌PCN测定,Triton X-100煮沸法更适合于总DNA模板制备。

质粒拷贝数的测定方法

在研究生物工程重组蛋白产量的过程中 ,质粒的拷贝数是一个需要重点考虑的参数 ,对它进行精确定量至关重要。本文概述了几种主要的测定方法的原理和特点。

p LA-PEDV-S1质粒拷贝数与发酵重组乳酸菌S1表达量之间的相关性研究

探究质粒拷贝数以及目标蛋白S1表达量与发酵时间的关系,从而确定放大生产p LA-PEDV-S1/Lactobacillus casei的最佳发酵时间。通过发酵重组干酪乳杆菌,绘制重组干酪乳杆菌的生长曲线,确定其生长的最佳时期。将p LA-PEDV-S1/L. casei分别接种至添加抗生素和不添加抗生素的MRS培养基中传代培养,进行稳定性实验。使用荧光定量PCR方法检测重组干酪乳杆菌中质粒的拷贝数,使用流式细胞术检测乳酸菌表达的目标蛋白。重组菌在7 h达到生长顶点,传至120代时外源质粒并无丢失情况出现。质粒拷贝数在9 h达到峰值29. 34,表达目标蛋白的重组菌在7 h达到峰值97. 98%。结果显示在细菌生长的对数生长期末期,质粒拷贝数最高且S1表达量最多;在平台期随着发酵时间的增加,质粒拷贝数逐渐降低,S1表达量也相应减少。发酵的最佳时间为7～10 h,质粒拷贝数与S1表达量之间存在着正相关性。

调控质粒拷贝数优化酿酒酵母异源合成真菌聚酮10,11-dehydrocurvularin

10,11-dehydrocurvularin是一种来源于真菌Aspergillus terreus的一种具有多种生物活性的聚酮化合物。课题组前期的工作中以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为宿主细胞,通过异源表达来源于A.terreus的还原性聚酮合酶(highly-reducing polyketide synthase,hrPKS)与非还原性聚酮合酶(non-reducing PKS,nrPKS)成功实现了10,11-dehydrocurvularin的合成。该研究通过调控质粒拷贝数,研究不同酶通量对多酶系统的最终产物产量的影响,以优化10,11-dehydrocurvularin在酿酒酵母中的产量。该研究以遗传霉素和潮霉素B两种抗生素抗性为选择压,通过截短抗性基因启动子长度,降低其单位拷贝抗性能力,经使用抗生素胁迫即可控制质粒拷贝数。结果表明,在一定抗生素浓度胁迫下,荧光及其质粒拷贝数与截短抗性基因的启动子长度呈负相关。将该系统分别应用至hrPKS和nrPKS,在遗传霉素与潮霉素B质量浓度都为300 mg/L的合成培养基中发酵2 d后,在构建的不同酶通量系统中,有不同程度的产量优化,其中启动子截短长度分别为全长和100 bp时,得到最优组合的产量为0.359 mg/L,为对照组的3.63倍。该研究表明在多酶系统中,通过组合优化酶表达量能够优化目标产物产量,但并非表达量越高效果越好,该研究将有利于今后非天然聚酮化合物的发现及优化生产。

多重PCR在质粒拷贝数检测中的应用

聚合酶链式反应(PCR)作为常规分子克隆技术已在分子生物学的各个领域得到广泛应用。然而,多重PCR技术应用于质粒拷贝数检测的研究尚未见报道。为深入探索多重PCR在质粒拷贝数测定中的应用,首先利用构建的多重PCR引物设计及评估体系分别针对细菌基因组DNA和质粒载体DNA序列设计多重PCR引物;然后以转化有不同质粒载体的大肠杆菌菌液为模板进行多重PCR反应;最后利用凝胶成像仪采集图像后进行积分光密度分析以获得质粒的相对拷贝数。结果显示通过多重PCR得到的质粒相对拷贝数与Real-time PCR和Southern blot的检测结果基本一致,说明多重PCR可用于质粒拷贝数的定性检测。利用多重PCR技术建立了一种便捷的质粒拷贝数检测方法,为在宿主细胞中快速确定克隆载体或表达载体的相对含量提供了参考。

用实时定量PCR方法测定萘降解质粒pND6-1的拷贝数

Pseudomonas putida ND6是一个高效降解萘的菌株,含有101 858 bp的萘降解质粒pND6-1.用实时定量PCR方法测定了Pseudomonas putida ND6菌株中pND6-1的拷贝数为2.这是第一个测定分子大小超过100 kb的细菌大质粒拷贝数的报道.

La(Ⅲ)对质粒pUC18复制拷贝数的影响

稀土应用的日益增长将会对生物的遗传产生深远的影响。生物的遗传离不开DNA的复制,由于染色体DNA非常巨大和复杂,难以直接研究稀土离子对其复制的影响。本研究以细菌染色体之外的遗传因子——质粒为对象,研究L a3+对质粒DNA复制拷贝数的影响。结果表明:在不同浓度L a3+存在下,质粒在宿主细胞中复制的拷贝数不同;因培养时间相同,因此质粒在宿主细胞中复制的平均速率不同。由于质粒复制与染色体DNA复制使用相同的酶系,因而可初步推断不同浓度的L a3+对染色体DNA复制的平均速率有同样的影响。

实时定量PCR测定爱德华氏菌隐蔽质粒的拷贝数

为测定爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)隐蔽质粒的拷贝数,并探究不同基因组制备方式及定量策略对质粒拷贝数测定的影响,分别采用试剂盒和水煮法制备爱德华氏菌基因组,通过绝对定量和相对定量PCR测定两种不同总DNA制备方式下的隐蔽质粒拷贝数,同时测定试剂盒对染色体DNA和质粒DNA的回收率。结果显示,以试剂盒提取的总DNA测得的pEI1和p EI2拷贝数绝对定量和相对定量分别为3.63±0.30、5.04±0.18和4.22±0.15、5.13±0.50,显著低于以水煮法测得的pEI1和p EI2拷贝数的绝对定量11.84±0.80、11.70±0.25和相对定量13.85±1.64、11.90±0.97。回收率结果显示,试剂盒对染色体DNA的回收率(45.8±4.1)%,显著高于对质粒pEII的回收率(25.1±0.5)%和pEI2的回收率(31.3±1.7)%。结果表明:通过实时定量PCR测定爱德华氏菌隐蔽质粒的拷贝数时,基因组的制备以水煮法为宜,爱德华氏菌隐蔽质粒pEI1和pEI2均属于中拷贝质粒。

实时定量PCR测定苏云金芽胞杆菌质粒pBMB67的拷贝数

根据苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT-1520的全基因组测序结果,在内生质粒p BMB67和染色体上分别选取单拷贝片段,利用实时荧光定量PCR法测得质粒p BMB67的拷贝数为21。此外,在内生质粒p BMB67的3个不同位点设计引物,分别以不同的靶片段作为实时荧光定量PCR的检测对象,测得p BMB67质粒的拷贝数分别为20.1、21.0和21.3,表明单拷贝靶片段的选择对测定质粒的拷贝数没有影响,进一步证明了实时荧光定量PCR测定质粒拷贝数的可行性。

多拷贝脑钠肽基因表达质粒的构建及其表达

目的构建多拷贝脑钠肽(BNP)基因重组表达质粒,并探讨BNP基因的拷贝数与其表达水平的相关性。方法通过人工合成和PCR技术扩增BNP基因,将其克隆至载体pCW111中,构建表达质粒pBNP11,并通过亚克隆构建含有不同数量表达盒的正向串联表达质粒,分别转化大肠杆菌DH5α和BL21(DE3),经温度诱导表达,SDS-PAGE分析,并经激光扫描测定目的蛋白的表达量。结果测序及酶切鉴定证明1～3拷贝BNP重组表达质粒构建正确,重组蛋白在大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)中均可获得表达,表达量分别为菌体总蛋白的8.12%、9.94%、和9.18%。结论已构建了多拷贝BNP的重组表达质粒,BNP的表达水平随BNP拷贝数的增加而升高,但并未成倍增加。

产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究

成功构建了腈水合酶(nitrile hydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr),研究了重组质粒pETNHM在重组菌株中的质粒稳定性。结果表明,pETNHM具有较好的结构稳定性,连续传代60代后质粒的基因序列没有明显缺失,且能够正常表达腈水合酶。pETNHM具有分离不稳定性,在无抗生素选择压力下,连续传代48代后质粒丢失的无质粒细胞开始出现。琼脂糖凝胶电泳定量分析表明,2/3的质粒pETNHM以二聚体形式存在,导致质粒拷贝数的下降。进一步研究表明,重组细胞的连续高速分裂及腈水合酶的高表达也会造成质粒拷贝数的下降,从而降低其分离稳定性。反之,重组菌株相对于宿主菌株的较高比生长速率有利于保持含质粒细胞的生长优势,卡那霉素的选择压力则能够保证质粒的稳定遗传。

稀土元素La(Ⅲ)对质粒pUC18复制速度的影响

稀土应用的日益增长将会对生物的遗传产生深远的影响 .生物的遗传离不开DNA的复制 ,由于染色体DNA非常巨大和复杂 ,难以直接研究稀土离子对其复制的影响 .以细菌染色体之外的遗传因子———质粒为对象 ,研究La3+对质粒DNA复制速度的影响 .结果表明 :在不同浓度La3+存在下 ,质粒在宿主细胞中复制的速度不同 ;由于质粒复制与染色体DNA复制使用相同的酶系 。

重组质粒pUC-CK在大肠杆菌中表达条件的优化

目的 :优化含PKCε催化功能域基因的重组质粒 pUC -CK在大肠杆菌中表达的最佳条件 方法 :含重组质粒大肠杆菌培养、表达产物的SDS -PAGE电泳及Westernblot检测 结果 :PKCε催化功能域在大肠杆菌中表达的最佳条件为 :含重组质粒大肠杆菌过夜培养时加入 0 1%的葡萄糖增加质粒拷贝数 ;诱导剂(IPTG)的最适工作浓度为 0 5mmol/L ;诱导最适培养温度为 30℃ ;诱导培养时间为 2～ 3h用于检测 ,6～2 4h用于分离纯化 结论 :PKCε催化功能域在大肠杆菌中成功表达 ,为今后大量表达、纯化该酶蛋白作了前期铺垫 .

操纵子重复克隆以提高外源基因的表达水平及同一大肠杆菌细胞内质粒DNA总量为一常数的新概念

目的 确定在一个表达质粒载体上串联目的操纵子以提高目的蛋白表达量的可行性 ,阐明宿主细胞对胞内质粒 DNA总量调控的可能机制。方法 亚克隆构建操纵子正向串联的表达载体 ;SDS凝胶电泳和激光扫描测定目的蛋白表达量 ;3H- Td R掺入法测定质粒拷贝数。结果 构建两组质粒 :CW11系列分别含 1～ 4个正向操纵子 ;CW12系列分别含 1～ 3个正向操纵子。在未诱导时 ,操纵子的串联不影响宿主大肠杆菌的生长 ;温度诱导表达后 ,CW11系列目的蛋白表达量分别为菌体总蛋白的 46 .0 %、5 4.8%、5 6 .1%和 6 0 .1% ,CW12系列目的蛋白表达量分别为菌体总蛋白的 33.5 %、44 .0 %和 47.1%。两组质粒的拷贝数均随操纵子串联个数的增加而减少 ,但目的基因的总剂量随之增加。实验数据同时表明 ,在相同的培养条件下 ,同一菌株每个宿主细胞内的质粒 DNA总量被限制在一定范围内。结论 操纵子串联增加了目的基因的剂量 ,从而提高了目的基因在大肠杆菌中的表达水平。另外 ,质粒大小和其拷贝数呈负相关 ,在同一培养条件下 ,对于特定的大肠杆菌菌株 ,宿主细胞内质粒 DNA总量在一定程度上是一个相对的被限定的常数。

哺乳类细胞基因表达系统

真核基因的转录和转译调控是哺乳类细胞基因表达系统建立和发展的基础,外源基因的表达水平不仅决定于启动子/增强子的强弱,还与剪接信号、终止信号和poly(A)信号以及质粒的拷贝数等因素有关。另外,在基因治疗的研究中,也已寻找到多种具有组织或肿瘤特异性的启动子,来达到特异性肿瘤基因治疗的目的。

不依赖IPTG诱导产木糖醇大肠杆菌工程菌的构建

该研究采用分子生物学技术构建不依赖异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产木糖醇的大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌,并研究启动子、质粒拷贝数、诱导剂IPTG的添加、基因xylA和xylB的敲除以及木糖含量对工程菌发酵产木糖醇的影响。结果表明,当转速为200 r/min时,E.coli AI07/pWYZ-1(启动子为lacP)的木糖醇产量是E.coli AI07/pAGI02(启动子为pflB-p6)的1.8倍;E.coli AI07/pWYZ-2(中拷贝质粒pBR322)的木糖醇产量高于E.coli AI07/pWYZ-1(高拷贝质粒pUC19),分别为19.56 g/L、7.90 g/L;是否添加诱导剂IPTG对E.coli AI07/pWYZ-2产木糖醇影响不大,且在发酵96 h时,木糖醇产量极显著高于E.coli AI05/pWYZ-2(P<0.01),其在不添加IPTG的条件下,当木糖初始质量浓度为80 g/L,发酵时间为108 h时,木糖醇产量达48.7 g/L。

发现了细菌细胞的复制开关

斯坦福大学的科学家鉴定出一种终止细菌复制的蛋白.这一发现有助于人们进一步了解生长的基本过程,为癌症和艾滋病研究、也为生物技术产品的生产开辟了新的前景.特别是能针对新蛋白的氨基酸序列制备出寡核苷酸,这就为研究染色体起始的调节机制提供了有力工具.