核蛋白H-NS调控多重耐药鸡大肠埃希菌IncFⅡ质粒接合转移的分子机制

【目的】以临床分离的多重耐药鸡大肠埃希菌IncFⅡ质粒为研究对象,探究核蛋白H-NS调控其接合转移的分子机制,为控制IncFⅡ质粒介导的多重耐药基因水平散播提供理论依据。【方法】测定大肠埃希菌ATCC25922及4株重组菌(pBAD25922、F25922、FΔhns和FΔhns/phns)的生长曲线,比较hns对菌株的影响情况;分别以F25922、FΔhns和FΔhns/phns为供体菌,大肠埃希菌J53(耐叠氮钠)为受体菌,进行接合试验,并计算接合频率;采用实时荧光定量PCR检测各重组菌(F25922、FΔhns和FΔhns/phns)中IncFⅡ质粒接合转移相关基因(traM、traJ和traY)的mRNA表达量;构建LacZ融合报告菌株F25922/P_(M)(P_(J)/P_(Y))、FΔhns/P_(M)(P_(J)/P_(Y))和FΔhns/phns/P_(M)(P_(J)/P_(Y)),分别测定不同菌株中3种基因(traM、traJ和traY)启动子P_(M)、P_(J)和P_(Y)的β-半乳糖苷酶活性;构建H-NS蛋白原核表达载体,采用镍离子亲和层析法分离纯化H-NS核蛋白,PCR扩增并纯化3种基因启动子区的DNA序列,利用电泳迁移率变动分析试验(EMSA)探明核蛋白H-NS调控IncFⅡ质粒接合作用的调控方式,预测H-NS与不同启动子的结合位点并用EMSA进行进一步验证。【结果】重组菌F25922和pBAD25922与大肠埃希菌ATCC25922的生长状况无明显差异,说明质粒pBAD和IncFⅡ均不影响宿主菌大肠埃希菌ATCC25922的生长;但是,缺失重组菌FΔhns和缺失回补重组菌FΔhns/phns的生长速度明显低于大肠埃希菌ATCC25922,表明hns的缺失导致菌株的生长适应性变差,但不影响菌株的存活。接合试验结果显示,FΔhns中IncFⅡ质粒的接合频率较对照菌F25922升高了1279.33倍(P<0.001),而FΔhns/phns中IncFⅡ质粒的接合频率虽未完全恢复到对照菌株的水平,但也明显低于FΔhns。实时荧光定量PCR结果显示,FΔhns中tra基因(traM、traJ和traY)的mRNA表达量均极显著高于对照菌株(P<0.001),其中traJ的mRNA表达量最高,为F25922的1510.14倍,其次为traY和traM,表达量分别为F25922的448.14倍和81.54倍,而回补株FΔhns/phns中不同基因的mRNA表达量均极显著低于FΔhns,与对照菌相类似。β-半乳糖苷酶活性测定结果显示,缺失报告菌株FΔhns/P_(M)(P_(J)/P_(Y))中P_(M)、P_(J)和P_(Y)的β-半乳糖苷酶活性分别为5.66,10.45和21.91,均极显著高于对照菌F25922/P_(M)(P_(J)/P_(Y))的相应启动子(P<0.001),而回补报告菌株FΔhns/phns/P_(M)(P_(J)/P_(Y))中P_(M)、P_(J)和P_(Y)的β-半乳糖苷酶活性极显著低于FΔhns/P_(M)(P_(J)/P_(Y)),且均与对照菌株无明显差异。这些结果均表明hns对IncFⅡ质粒接合转移呈明显的负调控作用。EMSA结果显示,H-NS核蛋白均能明显阻滞3个tra基因启动子DNA的迁移,说明H-NS可直接与tra基因的3个启动子区结合;通过对结合位点的预测和EMSA进一步验证,证实H-NS核蛋白可与3个启动子区的AT富集区结合。【结论】H-NS核蛋白通过直接与IncFⅡ质粒的traM、traJ和traY的启动子区的AT富集区结合,抑制启动子活性,从而导致启动子下游相关转移基因traM、traJ和traY的表达量下降,结果明显抑制IncFⅡ质粒的接合转移。