耻垢分枝杆菌烯酰辅酶A水合酶编码基因表达分析及其敲除质粒的构建

胆固醇是某些病原菌胞内生存所必需的碳源和能源物质,而胆固醇的各种代谢酶是潜在的药物作用靶点.烯酰辅酶A水合酶主要参与了脂肪酸的β-氧化循环,但其在胆固醇降解中的作用机理尚不完全清楚.首先对耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis MC2155)进行了全基因组搜索,获得了18个烯酰辅酶A水合酶的候选基因.对在不同甾醇类化合物条件下的转录组测序结果进行了分析,发现18个候选基因差异表达明显,其中位于胆固醇降解基因簇中的MSMEG_5915(ech A19),在胆固醇条件下表达明显上调,MSMEG_5915(ech A19)可能参与了胆固醇的侧链降解.最后,构建了MSMEG_5915的敲除质粒,并对耻垢分枝杆菌进行了基因转化.经PCR快速分子鉴定,MSMEG_5915基因被同源整合于耻垢分枝杆菌染色体上.为进一步揭示MSMEG_5915(ech A19)基因的功能奠定了基础.

人白细胞介素-26慢病毒表达质粒与基因敲除质粒的构建及其在HEK293T细胞中的活性验证

目的 构建人白细胞介素(interleukin,IL)-26慢病毒表达质粒与基因敲除质粒,为研究IL-26基因在细胞信号通路及细胞自噬中的功能奠定基础。方法 利用RT-PCR从人外周血单个核细胞中扩增IL-26基因序列,克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP真核表达载体中,构建过表达质粒;并根据IL-26外显子序列设计4个敲除靶点Exon1sgRNA1、Exon1sgRNA2、Exon3sgRNA1、Exon3sgRNA2,利用CRISPR/Cas9技术构建至lentiCRISPRv2载体中,构建基因敲除质粒。将过表达质粒和基因敲除质粒分别瞬时转染至HEK293T细胞,利用RT-qPCR和Western blot验证IL-26 mRNA和蛋白的表达情况。并对IL-26进行氨基酸序列分析、结构预测及亚细胞定位观察。结果 通过酶切、测序鉴定及生物信息学分析显示,IL-26全长516 bp,编码171个氨基酸。IL-26过表达质粒转染的HEK293T细胞与正常对照组相比,IL-26 mRNA水平升高了656.789倍,蛋白质水平升高了1.978倍,差异均有统计学意义(t分别为17.976和7.859,P分别<0.000 1和<0.001)。4个敲除靶点Exon1sgRNA1、Exon1sgRNA2、Exon3sgRNA1、Exon3sgRNA2质粒转染至HEK293T细胞中后,IL-26的表达水平分别下降了0.930、0.980、0.523 3和0.316 9倍,其中Exon3-sgRNA2质粒能够显著下调IL-26的表达(t=7.440,P <0.001)。IL-26蛋白的前22个氨基酸存在信号肽结构,且具有一定的跨膜功能,IL-26存在于细胞质中。结论 成功构建了IL-26过表达和基因敲除质粒,为后续IL-26功能的研究奠定了基础。

溶解肠杆菌YH16抗汞操纵子的克隆与分析

目的通过对从污染地区分离出的抗汞菌株——溶解肠杆菌YH16的研究,获得新的抗汞操纵子基因,为汞污染环境的微生物修复打下基础。方法通过质粒消除实验确定抗汞基因的位置,通过构建基因文库的方式筛选获得新的抗汞操纵子基因(mer)。结果YH16的抗汞操纵子位于质粒上,该操纵子长达6048bp,由7个ORF组成,依次为merT、merP、merC、merA、merD、tnpA、tnpA,与典型的Tn501mer操纵子和Tn21mer操纵子相比,缺少merR。结论获得了缺少merR基因的mer操纵子,具有理论研究意义,并为抗汞工程菌的构建打下基础。

大肠杆菌hfq和rne-710基因的双质粒无痕敲除技术

基因敲除技术是了解基因功能的重要技术手段。以大肠杆菌K-12 MG1655基因组hfq(309 bp)和rne-710(1056 bp)基因为模型,首先构建Δhfq∷Spe和Δrne-710∷Spe菌株,通过融合PCR方法分别构建缺失hfq(309 bp)和rne-710(1056 bp)的融合片段并连接至辅助质粒,缺失hfq和rne-710的片段经重组分别替换壮观霉素抗性盒,得到无痕敲除株Δhfq和Δrne-710。双质粒无痕敲除和融合PCR方法相结合为大片段基因缺失开辟了新的途径。