血管内皮生长因子(VEGF)实时荧光定量PCR质粒标准品的构建

应用SYBR Green荧光染料检测方法构建VEGF基因质粒标准品,能快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要候选基因血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。本研究利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。建立的VEGF基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达1.0×103拷贝,线性范围达1.0×103～1.0×108拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(r2=0.982),扩增效率高(E=96.92%)。通过构建版纳微型猪近交系VEGF基因质粒标准品,为探讨VEGF基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。

线粒体转录复合物各因子质粒标准品的构建

目的:构建大鼠线粒体转录因子TFAM(A)、线粒体转录因子TFB1M(B1)、线粒体转录TFB2M(B2)及线粒体RNA聚合酶(POLRMT)的质粒标准品,为检测内耳细胞线粒体TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT的mRNA表达水平做基础。方法:设计特异性引物和探针,提取大鼠内耳组织总mRNA逆转录成c DNA,PCR扩增、纯化目的片段,将纯化产物与p Zero Back/blunt载体重组,提取重组质粒,经测序鉴定后,用实时荧光绝对定量PCR建立标准曲线。结果:测序结果与各目的序列一致,获得良好的标准曲线(R2>0.99)。结论:成功构建了各目的基因的质粒标准品。

稀释剂种类和冻融次数对质粒标准品实时荧光定量PCR检测的影响

目的探讨稀释剂种类和冻融次数这两种因素对实时荧光定量PCR检测中质粒标准品的影响。方法 分别采用ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂将质粒标准品稀释为1×10^8、1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4拷贝/μl的5个浓度检测液各5份,在冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后进行实时荧光定量PCR检测,比较其Ct值。结果 ①浓度1×10^8、1×10^7、1×10^6、1×10^5、1×10^4拷贝/μl时,冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次之后,质粒标准品在ddH2O和TE缓冲液两种稀释剂中,实时荧光定量PCR检测Ct值中位数分别为17.46和17.32(P>0.05),23.52和23.61(P>0.05),26.77和26.37(P>0.05),32.73和30.88(P<0.05),33.08和31.51(P<0.05)。②冻融1次、5次、10次、15次、20次和25次,在ddH2O和TE缓冲液中,各浓度标准品Ct值中位数分别如下:1×108拷贝/μl:17.43、17.56、17.45、17.45、17.26、17.94(P>0.05)和17.38、17.36、17.47、17.31、17.30、17.62(P>0.05);1×10^7拷贝/μl:22.17、23.16、24.12、23.51、23.94、23.89(P<0.05)和22.40、24.09、24.07、23.54、23.68、24.05(P<0.05);1×10^6拷贝/μl:24.66、25.27、26.66、27.29、27.78、27.40(P<0.05)和24.92、26.22、26.31、26.59、26.93、26.53(P<0.05);1×10^5拷贝/μl:29.25、30.66、32.72、32.84、33.27、33.39(P<0.05)和29.21、30.10、30.97、30.87、31.72、32.44(P<0.05);1×10^4拷贝/μl:31.05、30.50、32.99、33.21、33.59、33.41(P<0.05)和31.22、31.28、31.49、31.52、32.37、32.31(P<0.05)。结论 相对于ddH2O,质粒标准品选择用TE缓冲液作为稀释剂更稳定。质粒标准品随着冻融次数增多,其稳定性越差,因此要避免反复冻融质粒标准品。

黄曲条跳甲钾离子通道基因实时荧光定量PCR质粒标准品的构建

构建黄曲条跳甲钾离子通道基因(twk)荧光实时定量PCR标准品。利用twk基因为目的基因设计引物,通过PCR、电泳、胶回收,然后与pMD18-T Vector连接并转化到感受态大肠杆菌中;氨苄青霉素筛选出白色菌落,进行菌落PCR及测序鉴定其特异性,根据OD值确定浓度,制备梯度浓度参考标准品,制作标准曲线。成功构建了twk基因实时荧光定量PCR质粒标准品,为黄曲条跳甲体内twk的精确定量,以及其他靶标基因表达的定量分析提供了重要参考。

叉头转录因子1质粒标准品的构建

背景:研究表明叉头转录因子1是一种新的2型糖尿病易感基因,但2型糖尿病患者与健康人的叉头转录因子1基因在转录水平上差异性的研究不多。由于还没有商品化叉头转录因子1的质粒标准品,因此有必要构建其标准品。目的:构建应用实时荧光定量-聚合酶链反应检测叉头转录因子1mRNA的质粒标准品。设计、时间及地点:单一样本重复实验,于2007-11/2008-03在苏州大学附属第一医院检验科实验室完成。材料:SYBRExScriptTM反转录-聚合酶链反应Kit试剂盒,SYBRPremixExTaqTM试剂盒,凝胶回收纯化DNA试剂盒,质粒DNA小量纯化试剂盒,PMD18-TVector试剂盒等。方法:从健康志愿者血标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板应用聚合酶链反应扩增出目的片段,对其回收纯化连接到PMD18-T载体及转化JM109,阳性克隆经测序分析,确认重组质粒正确。抽提重组质粒,用紫外分光光度仪测定其浓度,再根据公式换算成拷贝浓度,最后稀释成梯度标准品。主要观察指标:重组质粒聚合酶链反应和基因测序结果,标准品标准曲线的相关系数及标准品的重复性。结果:成功构建了叉头转录因子1质粒标准品,通过聚合酶链反应及基因测序鉴定其目的片段已成功插入载体。各稀释度的标准品经荧光定量-聚合酶链反应扩增后,其循环阈值与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系,线性范围是2.39×(105～1012)copies/mL。各稀释度标准品的批内重复性好,其变异系数范围为0.29%～1.16%。结论:实验成功构建了具有较好灵敏度和重复性的叉头转录因子1质粒标准品。

IL28B基因多态性检测的质粒标准品构建

人类白介素28b(IL28b)的SNP位点rs12980275的多态性(AA、AG和GG)与聚乙二醇干扰素、利巴韦林联合治疗的效果具有显著相关性。为了确保rs12980275预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果的价值,需要构建标准品作为rs12980275检测的标准对照。提取人类外周血基因组DNA,以IL28B SNP rs12980275为目的基因片段设计引物,进行PCR扩增;纯化目的片段与pGM-T Vector连接并转化到大肠杆菌中;提取重组质粒DNA,并进行PCR、测序鉴定。结果 IL28B SNP rs12980275目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性与序列完整性。成功构建了IL28B基因SNP rs12980275突变检测的AA、AG和GG 3种质粒标准品,可作为预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果rs12980275突变检测的阳性质控物。

草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建

构建草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR的标准品和标准曲线。通过培养草菇菌丝,提取总RNA并逆转录为cDNA后进行PCR扩增,电泳后纯化产物,T-A克隆,测序,获得了预期质粒,提取质粒,梯度稀释构建标准曲线,取得了满意结果。为利用实时荧光定量PCR技术研究草菇冷诱导Cor3基因的表达奠定了基础。

反复冻融质粒标准品对荧光实时定量PCR实验的影响

目的评价反复冻融对不同浓度的real-time PCR质粒标准品的影响。方法用大肠杆菌DH5α感受态细胞克隆丰量的pMD-18T重组质粒,紫外分光光度计定量后,根据重组质粒分子量计算其拷贝数,稀释成梯度浓度的荧光实时定量PCR的标准品,取1.0×106、1.0×104和1.0×102拷贝/μl高中低3个浓度的标准品,反复冻融1、6、11、15次和21次后,以冻融后的质粒标准品为模板同时进行real-time PCR扩增定量,比较量值变化。结果反复冻融21次以内,高中值稳定,低浓度波动相对较大,高浓度质粒最大变化量为0.06个数量级;中浓度质粒最大变化量为0.18个数量级;低浓度质粒最大变化量为0.34个数量级。结论大于1.0×104拷贝/μl的高中浓度的质粒标准品可以耐受21次以内反复冻融,低于1.0×104拷贝/μl的质粒标准品反复冻融后量值变化较大,临床使用的试剂盒所配的低浓度标准品应避免反复冻融。

基于质粒标准品的HEV实时定量逆转录PCR检测方法的建立

目的 建立戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV）不同基因型RNA实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测方法及其所需质粒标准品,以利于临床一线实验室展开应用.方法 选取HEV ORF3高度保守区设计可检测HEV不同基因型病毒株的引物和探针;将拟扩增的HEV RNA目的基因片段构建成质粒,制备HEV质粒DNA标准品,用于浓度标准曲线及一步法qRT-PCR检测方法的建立;同时检测并分析HEV核酸与抗原和抗体之间的相关性;采用逆转录-巢式PCR（RT-nPCR）进行对比验证,并对部分阳性标本进行测序,通过生物进化树分析其流行病学特点.结果 成功建立基于HEV质粒标准品的qRT-PCR检测方法,适用于血清及粪便标本,最低检测限可达25拷贝/test;HEV核酸与抗原的检测结果具有较好的相关性,两者一致性达77.8%;经生物进化树分析发现9位HEV RNA阳性患者均感染为基因4型,但分属4a、4d和4n三个不同的基因亚型.结论 成功建立基于HEV质粒标准品的qRT-PCR检测方法,为后续临床应用商品化提供技术支持.

日本乙型脑炎病毒GⅢ型标准品质粒的构建

目的构建检测日本乙型脑炎病毒(JEV)GⅢ型拷贝数的质粒标准品,利用该质粒标准品定量检测病毒的拷贝数。方法通过设计引物经反转录聚合酶链反应扩增JEV相对保守区序列(prM结构蛋白),得到的目的片段克隆连接到pMD19-T载体上,从而获得JEV质粒标准品。随后,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)得到质粒标准品的标准曲线方程以及对JEV患者血清中病毒拷贝数进行检测。结果构建的JEV质粒标准品的RT-qPCR结果显示:相同浓度复孔间Ct值差异小(<0.5),熔解曲线峰值单一。得到的标准曲线方程为y=-0.2889 x+11.516,R 2=0.993,乙脑患者血清样品原液及倍比稀释度的病毒拷贝数分别为1184130.27、120912.86、10736.84、1053.45、121.25 copies/μL。结论本研究成功构建了检测JEV的质粒标准品,通过RT-qPCR发现其具有稳定性好、灵敏度高等优点,可应用于JEV拷贝数的定量检测。

实时荧光定量PCR检测人APRILmRNA的标准品构建

目的:构建增殖诱导配体(APRIL)基因的重组质粒的标准品。方法:从肺癌的组织标本中抽提总RNA逆转录合成cDNA,以cDNA为模板扩增目的片段,从胶中回收目的片段,再将回收的目的片段与pGEM-TEasy载体连接并转化宿主菌DH-5α,分别用菌落PCR及测序两种方法证实目的片段已成功转染细菌。抽提重组质粒DNA用核酸分析仪测浓度后换算成copies/ml。结果:成功构建了APRIL实时荧光定量标准品的线性范围105～1012copies/ml,批内与批间CV分别为1.34%～3.07%和7.24%～11.41%。结论:该法制备的质粒标准品具有较好的灵敏度和重复性,满足实时荧光定量实验要求。

人类疱疹病毒8型实时荧光定量PCR外标准品的构建

目的构建人类疱疹病毒8型(HHV-8)基因质粒标准品,以便快速、灵敏、可靠地检测与HHV-8相关疾病患者的病毒载量。方法提取HHV-8基因组DNA,以HHV-8 ORF26为目的基因设计引物,进行PCR扩增;纯化目的片段与pMD19-T Vector连接并转化到大肠杆菌中;提取重组质粒DNA,并行PCR、测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,实时荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)构建标准曲线。结果 HHV-8ORF26目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性和序列完整性,标准曲线参数良好,外标准品阈值循环数(Ct)与其相应梯度稀释浓度呈良好的线性关系,扩增效率高。结论成功构建了HHV-8的Real-time FQ-PCR外标准品,可以快速检测样品中的HHV-8载量。

大肠杆菌DNA定性标准物质的制备及在枸杞子污染检测中的应用

选取大肠杆菌毒力基因escV、stx2和hlyA为靶标序列构建质粒标准品,快速检测大肠杆菌。通过菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和测序对所构建的重组质粒进行验证,传15代测序验证质粒稳定性。制备escV、stx2、hlyA质粒标准品,对标准品进行检测限、均匀性、稳定性和定性实验。然后利用escV、stx2和hlyA质粒标准品对枸杞子中大肠杆菌进行检测。通过菌落PCR和测序结果表明escV、stx2和hlyA标准品制备成功。PCR体系对质粒标准品检测灵敏度达pg级别,并具有特异性,传15代测序的结果表明质粒标准品具有稳定性。escV、stx2和hlyA质粒标准品检测限分别为3.93×10^6、2.41×10^5拷贝/mL和2.14×10^5拷贝/mL,在25、4、-20℃条件下具有很好的稳定性和性质。escV、stx2和hlyA质粒标准品对34批枸杞子样品检测,escV、stx2没有被检测出,有3批枸杞子样品中检测出hlyA(检出率为8.82%)。参考GB 4789.6—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》方法结合16S rRNA测序对这3批枸杞子样品进行检测,结果没有检测出大肠杆菌,说明质粒标准品检测灵敏度高,相较于传统微生物分离鉴定,检出率有了很大的提高。

肉制品中沙门菌实时荧光定量聚合酶链反应标准质粒的构建

目的制备用于检测肉制品中沙门菌实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准质粒。方法设计针对沙门菌inv A基因的引物,扩增特异片段,转入质粒载体中构建重组质粒。将构建的重组质粒作为标准品,进行优化后的实时荧光定量PCR,建立标准曲线,并考察该标准品灵敏性及稳定性。结果成功构建含有沙门菌inv A基因的质粒标准品,用其建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板的拷贝数呈良好线性关系(r2=0.9979),最低可以检出10拷贝/反应。该标准质粒经验证具有良好的稳定性。用该质粒标准品检测肉制品中的沙门菌,经2 h增菌后,可在7 h内完成对样品的检测。结论所构建的质粒标准品可用于荧光定量PCR检测肉制品中的沙门菌,为考量实验质量提供参考依据。

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎(TGE)的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×107～1.0×101拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。

实时荧光定量RT-PCR法建立版纳微型猪近交系中厚皮创面转化生长因子表达体系

背景:版纳微型猪近交系能较好的模拟人取皮区创面,构建动物模型,检测与创面愈合及瘢痕形成密切相关的转化生长因子的表达。目的:观察创面愈合过程中转化生长因子β1基因的表达情况。方法:利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪构建了皮肤创面愈合动物模型,通过提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,对与创面愈合相关密切的转化生长因子β1基因进行了RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。结果与结论:建立的转化生长因子β1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达103拷贝/μL,线性范围达103～109拷贝/μL,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(R2=0.988),扩增效率高(E=107.433%)。利用该检测体系检测了45份样品,效果良好,该方法可为研究TGF-β1基因在创面愈合过程中的作用机理奠定分子生物学基础。

实时荧光定量PCR检测产琥珀酸丝状杆菌数量方法的研究

为建立产琥珀酸丝状杆菌定性定量研究方法,实现后期该菌种用于纤维素生物可再生能源等方面应用研究。本试验提取15份瘤胃细菌脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA),利用SYBR Premix Ex Taq荧光染料嵌合法和人工合成基因技术,采用实时荧光定量PCR方法检测样品中产琥珀酸丝状杆菌数量;结果:所构建的质粒DNA标准曲线线性关系良好,R2=1,所有样品溶解曲线均为单峰,扩增曲线呈S型,扩增效率为93.9%。表明应用构建实时荧光定量PCR法可对实际样品中产琥珀酸丝状杆菌进行定性定量研究。

CRLF2实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立人细胞因子受体样因子2（CRLF2）实时定量PCR检测方法。方法设计特异性引物扩增目的基因CRLF2及管家基因ABL,将纯化的PCR产物进行TA克隆,经菌落PCR筛选并测序鉴定后,提取重组质粒DNA,紫外分光光度计检测浓度换算成copies/mL浓度,稀释制备成质粒标准品,制作标准曲线观察灵敏度和线性范围,同时对质粒标准品的稳定性进行评估。初步应用该方法检测10例健康儿童和10例急性淋巴细胞白血病（ALL）初诊儿童的骨髓单个核细胞CRLF2水平。结果 CRLF2PCR产物具有单一特异的熔解曲线;标准品的线性检测范围为103~108 copies/mL;质粒标准品反复冻融3次仍旧稳定;临床标本的CRLF2水平均在标准品线性检测范围。结论该实验室建立的CRLF2实时定量PCR检测方法具有良好的特异性、线性范围和稳定性,可应用于临床ALL儿童CRLF2基因的定量检测。

单核细胞增生李斯特菌质粒DNA参考物质的研制

目的研制一种能够用于快速鉴定单核细胞增生李斯特菌(以下简称单增李斯特菌)的质粒DNA标准物质。方法设计一种质粒DNA包含目前常用于单增李斯特菌检测的hlyA、plcB、inlA基因,并对其稳定性、均匀性和量值可追溯性进行评价。评估其在实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测中的适用性。结果质粒DNA参考物质的最终定值结果为29.85μg/mL。该质粒DNA参考物质量值可靠,均匀性和稳定性良好,可以在-20℃下保存1年以上。质粒DNA参考品在实时荧光PCR检测中的适用性证明,可以保证实时定量PCR检测结果与单增李斯特菌基因组DNA参考品具有可比性。结论研制的质粒DNA标准物质可以替代单增李斯特菌基因组DNA对单增李斯特菌进行质量监控,满足单增李斯特菌检测在实验室质量的有效控制和试验方法验证的需要。