苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种质粒复制子ori165的克隆

以苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种菌株 (Bacillusthuringiensissubsp.tenebrionis)YBT 1 76 5作为出发菌株 ,克隆了一个包含复制子的EcoRI酶切片段 ,大小约为 1 1kb ,称为ori1 6 5。这是国内外从此亚种中克隆到的第一个复制子。缩小到 8kb左右后仍然能够复制。杂交结果显示 ,此复制子来源于菌株YBT 1 76 5可以检测到的分子量最大的质粒。以此复制子构建的穿梭载体pBMB6 0 71在不同受体菌中的稳定性差异很大 ,其中在以色列亚种无晶体突变株 4Q7中 ,传 40后代 ,稳定性 1 0 0 %。质粒pBMB6 0 71与含ori1 0 3 0和ori2 0 6 2在库斯塔克亚种无晶体突变株BMB1

重组代表IncFIB,K,U,Y,Z质粒群携带半乳糖操纵子的微型质粒

分别把代表 IncF1B,K,U,Y,Z 质粒群的复制子(rep)和非相容性(inc)位点同半乳糖(Gal)操纵子重组成六个微型Gal 标准 inc 群代表质粒(mini-gal),以Gal 发酵作为这些质粒的表型标记。还介绍一种简捷的采用 mini-gal 质粒进行质粒 inc分群的试验方法和检测 mini-gal 质粒稳定性的试验方法.

基于高灵敏度全细胞传感器的汞转化基因元件评价体系

汞是最具毒性的重金属之一;不同形态的汞具有的毒性差异大,发掘高效的不同汞形态转化的基因元件,通过合成生物学手段构建汞的微生物转化减毒体系是未来汞污染治理的重要方向;因此,发展和建立一套基因元件功能和效率的评价体系,是筛选高效汞形态转化基因的关键.基于MerR这一汞离子特异性响应蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因所构建的汞离子大肠杆菌细胞传感器,首先通过引入汞转运蛋白MerT提高汞离子的响应程度,构建含pUC57-MerT-MerR-GFP的细胞传感器.该传感器4h对氯化汞(HgCl_(2))的响应浓度为5-200μg/L,响应能力与汞离子浓度线性相关.在此基础上,将含有待测试汞转化基因的pACYC184质粒转入这一传感器,构建含相容性双质粒的大肠杆菌体系,通过GFP荧光的强度(胞内汞离子浓度)来评价待测基因是否具有将汞离子转化成其他形态的功能及其效率.抗生素处理下,相容性双质粒在大肠杆菌中拷贝数保持稳定,可用于基因元件评价.通过生物信息学分析,分别在原核生物蓝藻和单细胞真核生物四膜虫中鉴定和筛选了潜在的汞离子转化相关基因,包括半胱氨酸合成酶、胱硫醚-β-合成酶和半胱氨酸脱硫酶.利用所构建的大肠杆菌体系对蓝藻和四膜虫的基因元件进行评价,结果表明在100μg/L HgCl_(2)处理4 h下,含蓝藻半胱氨酸脱硫酶的大肠杆菌GFP荧光强度与对照组相比下降了79.5%,含四膜虫半胱氨酸脱硫酶的大肠杆菌GFP荧光强度与对照组相比下降了51.2%,说明两类生物中半胱氨酸脱硫酶能均能高效转化汞离子.本研究所构建的评价体系可用于上述原核生物基因元件和密码子优化后的真核生物基因元件,具备较强的响应速率、灵敏度和稳定性,为实现汞转化基因元件高通量筛选奠定了基础.