副鸡禽杆菌毒力质粒缺失株的构建及其致病性的研究

为研究副鸡禽杆菌(APG)质粒与菌株致病力的关系,本研究采用42℃诱导的方法缺失APG分离株APG-Hu中的毒力质粒,经PCR鉴定质粒缺失菌株后将其命名为APG-HuΔ。分别采用分光光度计测定OD600nm值法、微量生化鉴定管法、K-B纸片法和雏鸡感染试验测定APG-HuΔ的生长曲线、生化特性、药物敏感性和对雏鸡的致病性。结果显示,在42℃诱导条件下,能够有效缺失APG-Hu中的毒力质粒p250和p A14,而质粒p YMH5未被缺失;APG-HuΔ生化特性、生长曲线及耐药性与APG-Hu相比均无明显差异。雏鸡感染试验结果显示,多数APG-HuΔ感染鸡无明显临床症状,总体发病情况明显弱于同等剂量APG-Hu感染的鸡,表明APG-HuΔ毒力显著降低。本研究结果表明,APG毒力与质粒p250和p A14相关,而质粒p YMH5可能增加APG耐受多种抗生素的风险。本研究为APG致病机理及耐药机制研究奠定基础,也为挖掘APG质粒的应用潜力提供一定参考。

费氏中华根瘤菌共生质粒缺失对结瘤和固氮能力的影响

费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01在大豆上的结瘤表现为非品种专一性,其共生质粒pSymHN01b在诱动转入另一非品种专一性结瘤菌株WWG18SR后,获得的转移接合子WWG18SRN1中的pSymHN01b缺失约40 kb。盆栽结瘤试验证明,pSymHN01b的缺失导致WWG18SRN1由非品种结瘤菌株转变为大豆品种专一性结瘤菌株,并失去了在所有供试的大豆品种上固氮的能力。在获得了完整的pSymHN01b的转移接合子WWG18SRN2存在时,WWG18SRN1在黑农33上的结瘤受到抑制。

鼠衣原体质粒缺失株生物学特性及免疫保护性研究

目的以鼠衣原体(Chlamydia muridarum,CM)质粒缺失株CMUT3和CM972为对象研究质粒缺失对CM生物学特性的影响,评价质粒缺失株的免疫保护作用。方法碘染色观察衣原体包涵体中糖原聚集情况,间接免疫荧光法(IFA)和Western blot方法检测糖原合酶(GlgA)的表达,离心辅助感染试验检测衣原体对HeLa细胞的感染力。C3H/HeJ小鼠阴道感染CM,感染后60d内每隔3或7d取生殖道分泌物,检测包涵体形成单位(IFU);感染60d后处死小鼠,分离生殖道组织,观察输卵管水肿程度。CBA/J小鼠阴道感染CMUT3,感染后60d用CM菌株进行再次感染,观察质粒缺失菌株抗CM感染的免疫保护效果。结果 CMUT3和CM972菌株碘染色呈阴性;质粒影响GlgA的表达,质粒缺失后GlgA表达水平下降;离心因素能显著提高新分离质粒缺失株CMUT3对HeLa的感染力;C3H/HeJ小鼠下生殖道感染质粒缺失株CMUT3和CM972后不发生输卵管积水,而质粒缺失株在小鼠下生殖道的增殖与野生株比较差异不明显;CBA/J小鼠下生殖道免疫CMUT3后再感染CM,其单侧输卵管积水发生率为15%(2/13),而先行感染CM后再次感染CM的小鼠单侧或双侧输卵管积水发生率89%(8/9)。结论 CM质粒缺失株在小鼠生殖道中的致病力减弱,小鼠下生殖道免疫CMUT3后可抑制CM再感染所致的病理变化,CM质粒缺失株具有潜在的疫苗研究价值。

苏云金芽胞杆菌LM1212质粒缺失对细胞分化的影响

【目的】苏云金芽胞杆菌LM1212与传统Bt相比,芽胞和晶体形成产生了分化,研究目的是明确质粒缺失对LM1212菌株细胞分化的影响。【方法】采用高温法对含有cry35-like基因启动子与lac Z基因融合质粒的LM(p35'Z)菌株进行内源大质粒缺失。在含X-gal的HCO平板培养初步筛选缺失突变株,进一步提取野生型及突变株的质粒进行脉冲场凝胶电泳分析,并用cry基因引物进行鉴定、激光共聚焦扫描显微镜和光学显微镜观察、芽胞形成率分析及利用SDS-PAGE和LC-MS/MS(Q-TOF)质谱分析质粒缺失对LM1212细胞分化和Cry蛋白表达的影响。【结果】筛选得到两株质粒缺失突变株LM(p35'Z)-W菌株和LM(p35'Z)-DB菌株,在含X-gal的HCO平板上,LM(p35'Z)-W菌株菌落颜色为白色,LM(p35'Z)-DB菌株菌落颜色为深蓝色,说明cry35-like基因启动子活性在这两株菌中受到影响;细胞形态观察发现LM(p35'Z)-DB菌株形成更多晶体产生细胞,LM(p35'Z)-W菌株形成更少晶体产生细胞。SDS-PAGE结果表明LM(p35'Z)-DB菌株Cry蛋白表达量提高,LM(p35'Z)-W菌株Cry蛋白表达量减少。【结论】LM1212质粒缺失可以影响细胞分化和晶体蛋白产量,此发现为深入解析LM1212细胞分化的调控机制和Bt菌株的遗传改良奠定了基础。

鸡痘病毒282E_4株2．2kbTK基因序列分析

将鸡痘病毒２８２Ｅ４弱毒株基因组中的３．７ｋｂＨｉｎｄⅢ片段克隆到ＫＳ（—）质粒中，亚克隆后，获得含ＴＫ基因正反方向插入的２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ－ＣｌａＩ片段的质粒ｐＫＦＡ和ｐＫＦＢ，进而构建出正反方向的系列嵌套缺失质粒。用Ｔ７、Ｔ３引物所做的核苷酸序列分析表明，２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ－ＣｌａＩＴＫ基因序列长为２１５９ｂｐ，含有两个完整的读码框架（ＯＲＦ）Ｘ和ＴＫ，并确证了ＴＫ基因内存在单一酶切点ＮｃｏＩ。由该片段内的重复序列分析发现，在Ｘ和ＴＫ两个ＯＲＦ侧翼存在１５ｂｐ的正向重复序列。

沙眼衣原体GlgA蛋白表达和分泌的调控机制

【背景】沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)的分泌蛋白在Ct与宿主细胞的相互作用、感染发育周期及致病过程中发挥着至关重要的作用。GlgA蛋白是课题组前期研究发现的一种新的Ct分泌蛋白,其表达和分泌的具体机制及作用还不清楚。【目的】寻找调控CtGlgA蛋白表达和分泌的分子机制,为后续Ct致病机制研究提供实验基础和新思路。【方法】采用Signal P 4.1软件对GlgA蛋白N端进行信号肽预测分析,并用细菌分泌蛋白特异性阻断剂C16和C1化合物分别或同时处理Ct感染的He La细胞,观察阻断Ⅱ型、Ⅲ型分泌途径对GlgA蛋白分泌的影响;经新生霉素处理、噬斑筛选及穿梭质粒转染技术,构建Ct质粒缺失株和缺失互补株,并鉴定质粒编码基因在两种菌株的缺失及表达情况;间接免疫荧光法观察质粒缺失对GlgA表达和分泌的影响。【结果】GlgA蛋白N端无信号肽序列,细菌Ⅱ型、Ⅲ型分泌途径特异性阻断剂C16和C1化合物不能阻断GlgA的胞浆分泌;Ct质粒缺失株CTD1的质粒编码基因pgp7丢失,且质粒编码蛋白Pgp3及基因组编码蛋白GlgA的表达和分泌现象均消失;Ct缺失互补株CTD1-pGFP::SW2重新获得pgp7基因,并恢复Pgp3蛋白和GlgA的表达和分泌。【结论】初步证实Ct糖原合酶GlgA蛋白的表达和分泌不依赖细菌Ⅱ型和Ⅲ型分泌途径,而且与衣原体质粒密切相关。