BALB/c小鼠金属硫蛋白-1 cDNA基因在乳酸菌质粒表达载体pNZ2103上的克隆

目的用乳酸菌质粒表达载体pNZ2103克隆BALB/c小鼠金属硫蛋白(MT)-1 cDNA基因。方法设计一对含有限制酶Pst1和H indⅢ位点的引物。以质粒pET21 a-MT为模板,采用PCR法扩增BALB/c小鼠MT-1cDNA。用限制性内切酶Pst1和H indⅢ将MT-1 cDNA克隆于质粒pNZ2103形成重组质粒pNZ2103-MT。将pN2103-MT转化进入大肠埃希菌DH5α。采用PCR法和Pst1、H indⅢ双酶切方法鉴定含有pNZ2103-MT的转化子。12%SDS-PAGE鉴定pNZ2103-MT在大肠埃希菌DH5α的表达水平。结果获得含有pNZ2103-MT的DH5α转化子。结论以乳酸菌质粒表达载体pNZ2103构建的pNZ2103-MT在大肠埃希菌中表达水平较低,采用SDS-PAGE难以检测到表达水平的金属硫蛋白。

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的构建编码hVEGF165mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法以hVEGF165mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。结果构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功。靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显。结论成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒。

质粒表达载体转染HepG2.2.15和BEL-7402细胞的效率分析

目的:探讨pEGFP-N1质粒表达载体转染HepG2.2.15和BEL-7402两种肝癌细胞的效率。方法:提取、纯化pEGFP-N1质粒,采用脂质体将纯化的pEGFP-N1质粒转染HepG2.2.15和BEL-7402两种肝癌细胞。显微镜下观察细胞形态,分析转染效率。结果:HepG2.2.15细胞呈梭形或不规则三角形,可成层生长,有许多颗粒样物质和空泡。BEL-7402肝癌细胞呈梭形,相互拥挤呈现'铺路石'状。pEGFP-N1质粒转染HepG2.2.15细胞的转染率为27%,转染BEL-7402细胞的转染率为89%。结论:pEGFP-N1质粒转染BEL-7402细胞效率高于HepG2.2.15细胞。

猪TRIM56全长及其截短体真核表达质粒的构建及蛋白的表达和定位

本研究构建了猪TRIM56(sTRIM56)全长及其截短体的真核表达质粒,并检测了其融合蛋白的表达和定位。首先,根据sTRIM56基因序列及结构特点,设计扩增全长及4个截短体的引物,提取猪肺泡巨噬细胞3D4/21的总RNA,RT-PCR扩增sTRIM56全长及截短体基因,并将其克隆至pXJ41真核表达载体,构建全长及其截短体的真核表达质粒。其次,将sTRIM56全长及截短体真核表达质粒转染HEK-293T细胞,Western blotting检测其蛋白表达;转染猪肺泡巨噬细胞3D4/21,间接免疫荧光试验(IFA)检测其亚细胞定位。双酶切和测序结果显示,sTRIM56全长及截短体的真核表达质粒构建成功;sTRIM56蛋白约为82 kDa,与预期相符,各截短体蛋白条带也与预期相符;sTRIM56全长及4个截短体蛋白均主要定位于细胞质中。本研究结果可为后续深入研究sTRIM56蛋白及其不同结构域的抗病毒作用及分子机制奠定基础。

凋亡相关基因PNAS-2 siRNA质粒表达载体的构建、鉴定及转染后筛选方法的选择

硫化砷作用后急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞凋亡相关基因PNAS-2（apoptosis—related protein）表达显著降低。Busch等认为PANS-2基因与细胞增殖有关。我们前期的研究发现硫化砷作用后的急性早幼粒细胞白血病（APL）患者白血病细胞及NB4细胞PNAS-2基因表达特异性下调，且呈时间依赖性而K562和U937细胞则无此较应。为了进一步研究封闭该基因后对细胞凋亡的影响，我们扩增其5’端未知序列，构建了PNAS-2 siRNA质粒表达载体并转染U937细胞，筛选、纯化转染细胞后检测U937细胞凋亡的变化以初步了解PNAS-2的作用。

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达。尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究。目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒。设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成。材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所。方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段,构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1～4)并行酶切鉴定分析。然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48h后测定转染率。主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果。转染效率。采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达。结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒。重组质粒经酶切鉴定证实构建成功。质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%。短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%。结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用。短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显。

猪Ghrelin基因表达质粒构建及其促生长作用

通过RT-PCR获得猪Ghlelin基因cDNA片段,克隆入pcDNA3.1(+)质粒中构建真核表达质粒pcDNA-pGhl,并将该质粒注射到大鼠和新西兰兔后腿肌肉中,以研究pGhlelin真核表达质粒对动物生长和血液相关激素分泌的影响。大鼠试验表明:pcDNA-pGhl在注射初期的1个月内有增加大鼠体重及在整个试验期有降低料重比的趋势。在注射质粒后第6天,试验组个体增重提高10.6%,差异显著;饲料转化率提高10%,差异极显著。新西兰兔试验表明:试验组血液GH水平一直高于对照组,且在注射后2周高出35%,同时随着GH浓度的增加,血液中SS的浓度相应升高。注射重组质粒pcDNA-sGhl有增加血浆GH和SS水平趋势。以上结果表明,Ghrelin基因真核表达质粒通过促进GH的分泌促进生长,但其促生长效能较短暂,可能是由于同时促进生长抑素分泌。

卵泡抑制素与乙肝表面抗原融合基因表达质粒的构建及表达

目的 :构建高免疫原性的抑制素真核表达载体。方法 :通过PCR扩增pCMV S基因中的S基因片段 ,然后将抑制素α(1 32 )片段与S的融合基因克隆到真核表达质粒pcDNA13.1( ) :酶切、测序鉴定后 ,采用脂质体包裹法将重组质粒转染Hela细胞 ,用SDS PAGE和ELISA对其表达产物进行检测。用抑制素融合表达质粒免疫大白鼠 ,ELISA检测血中抗抑制素抗体水平。结果 :酶切鉴定和序列分析表明 ,融合基因的表达质粒pClS构建成功。表达质粒在HeLa细胞中获得了表达 ,融合蛋白的分子量约为 2 9kD ,融合蛋白具有抑制素免疫原性。重组质粒免疫使大白鼠产生了抗抑制素抗体。结论 :高免疫原性的抑制素表达质粒的构建为利用抑制素基因免疫技术诱导单胎动物生多胎奠定了基础。

我国登革2/4型病毒株Pr-M-E基因的双表达质粒构建及在真核细胞中的共表达

将我国登革 2、4型病毒分离株PrM E基因通过RT PCR以病毒RNA为模板扩增我国登革 2型 4 3株和 4型B5株的PrM E基因 .并分别克隆至pGEM TEasy载体 ,然后亚克隆至双顺反子表达质粒的两个多克隆位点 ,获得同时含有登革 2型 4 3株和 4型B5株PrM E基因的双顺反子重组表达质粒pIDME2 4 .在用该重组质粒转染的BHK2 1细胞中 ,不但可检测到PrM E基因的转录产物 ,而且采用间接免疫荧光法还可观察到针对登革 2型 4型病毒的特异荧光 .研究结果表明 ,重组的双顺反子表达质粒在真核细胞中可共表达登革两个血清型PrM E基因 。

蜘蛛杀虫肽基因的合成及其在植物中表达质粒的构建

According to amino acid sequence of the insecticidal peptide found in venom of Australia spider, the gene was constructed in four sections by annealing partially complementary single stranded oligos using code preferred in plant. After having been sequenced, this gene was constructed into the plasmid expressing in plant.

布氏杆菌BCSP_(31)/pVAX1重组表达质粒的构建及其免疫保护效果的研究

目的构建布氏杆菌BCSP31/pVAX1重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察其免疫应答及免疫保护效果。方法克隆BCSP31基因,构建BCSP31/pVAX1重组表达质粒。转染COS7细胞,免疫组化检测其BCSP31蛋白抗原的表达。BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,观察特异性体液免疫和细胞免疫效果。进一步用1.25×104布氏杆菌A544强毒株腹腔攻毒,观察BCSP31/pVAX1重组表达质粒的免疫保护效果。结果扩增的BCSP31保护性抗原基因片断在牛、羊和猪布氏杆菌株中具有高度保守性,构建的BCSP31/pVAX1重组表达质粒在COS7细胞有目的蛋白抗原的表达。制备的BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉免疫BALB/c小鼠4次,ELISA检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒产生了较高水平的特异性IgG抗体,并随免疫次数增加抗体的滴度也递增,且抗体亚型以IgG2a为主,表明主要引起Th1型的免疫应答。FCM检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒的CD4+/CD8+比值明显下降,说明激发了显著的CTL效应。MTT测定BCSP31/pVAX1重组表达质粒的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异显著。布氏杆菌A544强毒株攻毒后,动物存活及脾组织细菌数与对照组比较有显著性差异,说明BCSP31/pVAX1重组表达质粒能够产生有效的保护效果。结论研制的BCSP31/pVAX1重组表达质粒免疫BALB/c小鼠能产生高水平的特异性体液免疫和细胞免疫,以细胞免疫为主,并产生有效的免疫保护效果,为布氏杆菌病新型疫苗的研究奠定了基础。

细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建

目的:克隆细粒棘球蚴 95 (Eg95 )抗原基因 ,构建携带目的基因的原核表达载体 ,为细粒棘球蚴抗原的免疫保护机制研究提供材料。 方法:应用 PCR方法从细粒棘球蚴 c DNA文库中克隆获得 Eg95抗原基因 ,将其克隆至 p U Cm- T载体 ,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将 Eg95抗原基因片段克隆至原核表达质粒 p ET2 8上 ,根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆 ,通过酶切分析和 PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序确定序列。结果:测序表明所有 p ET2 8- Eg95阳性克隆均为正确连接 Eg95抗原基因的重组质粒。结论:p ET2 8-

犬细小病毒HL-01株的分离鉴定及VP2基因真核表达质粒的构建

从临床发病犬采集粪便样品,以F81传代细胞进行病毒分离,经血球凝集实验(HA)和血球凝集抑制实验(HI)初步鉴定为犬细小病毒。为进一步确诊,根据Genbank中已发表的犬细小病毒VP2基因序列设计并合成一对引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出CPV VP2基因,酶切,测序加以鉴定。其序列与国际已发表的CPV-d(type 2)、CPV-1(5 type 2a)、CPV-3(9 type 2b)VP2序列同源性分别为98.97%,98.75%,98.69%,氨基酸序列的同源性分别为98.12%,97.60%,97.60%,从而证明此分离株为犬细小病毒。在获得VP2基因的基础上,为实现VP2蛋白的表达,构建了真核表达质粒pMel BacC-VP2。

猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究

构建了猪瘟病毒 (classicalswinefevervirus,CSFV)主要保护性抗原E2基因 4种不同的真核表达质粒。小鼠免疫试验表明 ,E2基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响 ,有信号肽序列的E2基因可诱导产生特异性免疫反应 ,且无跨膜区序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强 ,而无信号肽序列的E2基因则不能诱导产生CSFV特异性的免疫反应。攻毒保护试验表明 ,免疫家兔最少可抵抗 10个最小感染剂量 (MID)的猪瘟兔化弱毒苗 (Hogcholeralap inizedvirus,HCLV)的攻击 ;免疫猪可抵抗致死剂量的CSFV石门株强毒的攻击。

乙型肝炎HBsAg和GM-CSF融合表达质粒的构建及表达

目的 构建乙型肝炎HBsAg和GM CSF的融合表达质粒 ,借助GM CSF的免疫佐剂作用 ,提高乙型肝炎DNA疫苗的免疫效果。方法 用PCR方法及分子克隆技术构建融合表达质粒pcDNA3.1 S GM CSF和pcDNA3.1 GM CSF S ,并以重组质粒转染真核细胞 ,研究重组质粒体外表达。结果 经酶切鉴定及DNA序列证实重组质粒构建正确 ,细胞转染试验表明重组质粒能在COS 7及HepG 2内表达。结论 乙型肝炎HBsAg和GM CSF的融合表达质粒构建成功 。

鸡堆形艾美球虫3-1E基因真核表达质粒的构建及其抗球虫免疫保护作用

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从堆形艾美球虫SH株子孢子中扩增3-1E基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-3-1E。质粒纯化后体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光技术和免疫组织化学技术检测3-1E蛋白在转染细胞中的表达情况。将构建的重组质粒以及空载体质粒分别于14、21日龄分2次经腿部肌肉注射免疫SPF雏鸡,28日龄除非免疫非感染对照组外各组攻击性感染5×104个堆形艾美球虫孢子化卵囊,观察真核表达质粒对球虫感染鸡的免疫保护作用并探讨其免疫保护机理。结果显示,与载体对照组相比,质粒pcDNA3.1(+)-3-1E 2次免疫后可显著提高脾CD8+T淋巴细胞亚型数量,并具有一定的抗球虫免疫保护作用,可显著减少每克粪便的卵囊排出量,降低十二指肠病变记分,减少增重下降等。

细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的 克隆Eg95抗原基因 ,构建携带目的基因的真核表达载体 ,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料。方法 应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因 ,将其克隆至 pUCm -T载体 ,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上 ,根据选择标记的氨苄抗性基因筛选到阳性克隆 ,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序确定序列。结果 测序表明所选 pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接Eg95抗原基因的重组质粒 ,可以作为DNA疫苗作进一步的研究。结论 成功构建真核细胞表达载体 pcDNA3-Eg95。

存活素siRNA表达质粒的构建及其对MCF-7细胞细胞周期和增殖的调控(英文)

背景与目的存活素特异地在肿瘤组织中过表达,许多报道表明抑制它的功能对肿瘤治疗有利。RNA干扰被证明是一项能有效而特异地抑制基因表达的新技术。本研究的目的在于构建存活素基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒,并检测该质粒在乳腺癌细胞中的生物学功能。方法应用含有U6启动子的mU6pro载体构建存活素siRNA质粒,RT-PCR和Westernblot法检测该质粒转染MCF-7细胞后存活素表达的变化,流式细胞仪和MTT法分别检测其对细胞周期和对细胞增殖的影响。结果存活素siRNA质粒明显下调MCF-7细胞中存活素的表达,阻断细胞周期在G1期,显著抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。结论通过RNA干扰,存活素的表达在mRNA和蛋白质水平上被下调。

犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因的克隆和原核表达质粒的构建

通过设计特异性引物,以犬传染性肝炎患犬的全血基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得了犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因,将其插入到pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hex-on。结果显示,犬传染性肝炎病毒Hexon基因已被成功地克隆,基因全长2 718 bp,包含从起始密码子ATG到终止密码子TAA的完整序列。与犬传染性肝炎病毒国际标准株Hexon蛋白基因的同源性为99.7%,通过实验鉴定表明pMD18-Hexon克隆载体和原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hexon已成功构建。

双顺反子表达质粒在DNA疫苗研究中的应用

简述了DNA疫苗的研究概况,介绍了真核双表达质粒的结构特点及其在基因佐剂和二价DNA疫苗中的应用情况,总结分析了双表达质粒的优点和存在的问题,并对其今后在DNA疫苗中的研究方向和前景进行了展望。