枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究

为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进。用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DB1342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5 kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响。结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DB1342的转化率为750 CFU/μgDNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/μg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg DNA。根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内。

一种快速简便的CaCl_2质粒转化方法

介绍一种质粒DNA快速转化方法.质粒DNA加入感受态细胞,冰浴3～10min,涂布预热至37℃的平板,即可获得与常规转化方法相当的转化效率.操作步骤由5步减至2步,时间由2h减至3～10min.同时探讨了Ca2+浓度。

稀土元素铕对掌叶大黄Ri质粒转化根生长及蒽醌类成分的影响

试验研究了不同质量浓度的稀土元素铕(Eu3+)对掌叶大黄单克隆毛状根DH5c、DH7a和非转化根Nor生物量、蒽醌化合物合成的影响。结果表明:Eu3+浓度对不同类型大黄根的生物量积累作用效果不同。Eu3+对非转化根Nor和转化根DH7a的生物量积累有抑制作用,低浓度的Eu3+对转化根DH5c生物量积累有促进作用。Eu3+浓度对不同类型大黄根的蒽醌产量有不同影响。单克隆毛状根DH7a在Eu3+为0.1 mg/L和0.05 mg/L时蒽醌产量最高。经Eu3+处理的3种类型大黄根中芦荟大黄素和大黄酸高于大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。

简单高效的感受态细胞制备和质粒转化体系的建立

[目的]建立重复性好的感受态细胞的快速制备方法和质粒转化方法。[方法]采用改进的氯化钙法制备感受态细胞后,将带有目标片段的质粒转入感受态细胞,使工程菌DH5α转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌,接种于添加氨苄青霉素的LB培养基上,并通过蓝白斑筛选和菌落PCR进行检测。[结果]制备的感受态细菌在不加Amp的LB平板上能较好生长,表明感受态细菌具有较强活性。感受态细菌在添加Amp的平板上不能生长,表明感受态细菌未被杂菌污染。转化后获得白色菌落1 410个,转化率为1.41×105cfu/μg。菌落PCR表明获得的白色菌斑为带有目标片段的阳性菌斑。[结论]该方法十分简便,是一种适于实验室操作的高效感受态细胞的制备方法。

Ri质粒转化烟草的影响因素及豌豆凝集素基因在烟草发根中的表达

对Ri质粒转化烟草的影响因素进行研究 ,以期获得较为理想的实验系统 .用发根农杆菌介导 ,将豌豆凝集素基因导入烟草 ,获得转基因的烟草发根 .GUS组织化学染色、蛋白免疫原位杂交证明 ,gus报告基因和豌豆凝集素基因已在转基因烟草发根中得到了转译表达 .本结果将为根瘤菌能否扩大宿主范围 ,为研究烟草与豌豆根瘤菌相互作用、结瘤固氮的可能性奠定基础 .图 6参

适用于本科实验课教学的质粒转化方法

根据质粒转化实验的教学要求选择了氯化钙转化法,并结合高校实验教学条件,对其进行了改进。改进后的方法具有单人操作的可行性,实验结果清晰明了,仅需常规设备,教学成本较低,适合于高校本科实验课教学。

表皮葡萄球菌污染对质粒转化和抽提影响的实验研究

目的 :探讨导致部分质粒转化和抽提失败的原因。方法 :使用同一批DH5 α细菌制备感受态 ,转化、碱裂解法抽提和鉴定两种质粒 ,经抗性LB琼脂平板筛选和菌落分析 ,对照成功抽提和鉴定的质粒 ,分析部分质粒反复转化和抽提失败的原因。结果 :发现在该抽提失败的质粒所转化的抗性LB琼脂平板上存在两种菌落 ,大量白色菌落为表皮葡萄球菌 ,其过夜振摇产物经碱裂解法抽提质粒失败 ;极少数淡黄色菌落为大肠杆菌 ,经鉴定 ,质粒抽提成功。结论 :隐蔽的表皮葡萄球菌污染可能是导致部分质粒反复抽提失败的重要原因。

爱尔兰科研人员研究p16slux质粒转化血清易感大肠杆菌O111，以实现对牛乳杀菌效果基于补体的实时监测

直到最近才有研究者表征生牛乳的补体活性。研究发现，由于奶油分离过程中对牛乳进行加热或者相分配处理，先天免疫系统的补体活性逐渐降低。

Ri质粒转化牛膝及其发状根培养

用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒转化药用植物牛膝(Achyranthes bidentataBl.),诱导出了抗卡那霉素的发状根。将诱导的发状根进行固体平板培养和液体悬浮培养。在附加Km30mg/L的MS。和1/2MS。培养基上,发状根生长良好,而未经转化的对照组则死亡,表现出生长激素自主性。在附加外源激素IBA0.1mg/L和NAA0.1mg/L时。能促进发状根的成活、侧根的形成以及提高增殖倍数。表明适量的外源激素能促进发状根的生长。

含小鼠PPRE反应元件报告质粒的转化扩增

目的对含小鼠过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)报告质粒p4×PPRE-luc进行体外转化和扩增,为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供高纯度、高丰度的报告载体。方法取p4×PPRE-luc质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养,挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒,紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果经转化后获得了抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的p4×PPRE-luc质粒其A260/A280=1.84,浓度为750ng/μl。结论成功转化并扩增了p4×PPRE-luc质粒,为基于PPAR为靶标的药物筛选分子平台的建立提供了高纯度、高浓度的报告质粒。

CaCl_2法质粒转化最佳条件的探讨

ＣａＣｌ２法质粒转化中的一些关键性步骤的实验条件进行了探讨结果表明，ＣａＣｌ２处理对制备感受志受体菌是至关重要的，ＣａＣｌ２处理后的受体菌在４℃放置１６～２４ｈ是必要的．ＣａＣｌ２处理浓度以０．０７５ｍｏｌ·Ｌ－１最佳．为了得到足够的转化菌落，质粒加入量不应低于０．２μｇ．

质粒pXZ10145DNA转化棒杆菌原生质体的研究

用SDS处理谷氨酸棒杆菌1014(Corynebactertum glutamlcum 1014),获得消除质粒的衍生株1014-6。通过质粒pXZ10145(Cm^r)转化1014-6菌株的原生质体,研究了转化最适条件。0.6u/ml青霉素处理对数期菌体可明显提高转化效率。转化促进剂PEG以分子量6000、浓度30%为最佳。转化在37℃水浴进行3min效果最好。转化效率最高可达2×10~4转化子/μg DNA。质粒pXZ10145也已成功地转入钝齿棒杆菌B9(C.crenatum B9)。并在新宿主中基本保持稳定。

猪融合抗菌肽基因双质粒共转化重组毕赤酵母菌的构建

为构建高效表达的猪融合抗菌肽蛋白的重组酵母菌发酵表达体系,规模化生产制备新型免疫分子防控动物传染病,本试验从实验室先前构建的p GAPZαA-P质粒中克隆出已构建好的猪融合抗菌肽CAMPs基因片段。通过I nfusion技术,将C AMPs片段分别克隆入p PIC9K和p PICZαA真核表达质粒中,并通过P CR以及测序验证,成功构建了p PIC9K-CAMPs和p PICZαA-CAMPs重组质粒。通过电转化将线性化p PIC9K-CAMPs转入毕赤酵母G S115基因组中,并筛选高拷贝菌株G S-PK-CAMPs。再将线性化p PICZαA-CAMPs转入重组酵母G S-PK-CAMPs中,筛选出高拷贝菌株G S-PKZ-CAMPs。对重组酵母GS-PKZ-CAMPs进行诱导表达后作转录表达研究,检测抗菌肽是否表达。最终结果显示,成功获得了G S-PKZ-CAMPs可诱导表达菌株,这给猪融合抗菌肽蛋白的大规模发酵制备和应用于动物传染病的防治奠定了可靠的初步基础。

环孢素联合转化生长因子β1质粒对肝移植大鼠免疫反应的影响

背景:大多数肝移植患者会发生急性排斥或慢性排斥反应导致移植肝失功能,通过不同途径诱导特异性免疫耐受是解决肝移植排斥问题最理想的方法。目的:以注射转化生长因子β1质粒的方法对大鼠肝移植进行处理,从基因方面分析转化生长因子β1与移植免疫排斥反应的关系。方法:选用雄性Wistar大鼠30只为异基因肝移植供体,雄性SD大鼠10只为同基因肝移植供体。雄性SD大鼠40只为肝移植受体,以数字表法随机分为4组:同种基因移植组、同种异基因移植组、环孢素组、环孢素联合转化生长因子组。各组均采用改良Kamada二袖套法并加以改进建立稳定的大鼠原位肝移植模型。造模后,环孢素组给予环孢素1～5d,环孢素联合转化生长因子组腹腔注射环孢素A1～5d,同时腹腔注射转化生长因子质粒0～2d,其他两组不给予任何干预措施,记录大鼠生存时间。于移植后3,7,14,21,28d进行病理学、混合淋巴细胞培养。结果与结论:同种基因移植组、环孢素联合转化生长因子组大鼠生存时间均达60d以上,明显高于同种异基因移植组、环孢素组(P<0.05)。同种异基因移植组、环孢素组病理组织切片可见中-重度急性排斥反应,肝内炎细胞浸润较为明显,主要集中在汇管区;环孢素联合转化生长因子组移植肝内组织损伤程度明显减轻;同种基因移植组基本无排斥反应,接近正常肝组织。环孢素联合转化生长因子组混合淋巴细胞培养优于同种异基因移植组、环孢素组(P<0.05)。结果提示环孢素联合局部注射转化生长因子β1质粒可明显减轻大鼠肝移植移植后得免疫排斥反应。

氯化钇对质粒pBR322转化的影响

用含 50 μmol/ L钇 ( )的氯化钙诱导大肠杆菌进入感受态 ,质粒 p BR32 2的转化率提高2倍 ;若在热休克后使感受态细胞在含 50 μmol/ L氯化钇的营养培养基 (SOC)中复壮 ,则转化率提高 5倍 .实验结果表明 :微量氯化钇存在的条件下 ,钇 ( )可能比钙 ( )更易形成抗 DNase的羟基 -钇 ( ) -磷酸复合物 ,更易于被细胞吸收而提高了质粒的转化率 .

乙酰丁香酮对根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化的影响

研究了乙酰丁香酮 (AS)对根癌农杆菌介导的甘薯离体遗传转化的影响 .结果表明 :①菌液中加入AS不利于遗传转化 ;②AS的作用效果与培养基的 pH值有关 .培养基的 pH值为 5 8时 ,加入AS不能提高转化频率 ;而pH值为 5 2时 ,加入AS则能显著提高转化频率 ,特别是AS浓度为 2 5mg·L-1时 ,Kanr 芽获得率提高到 35 7%;③茎段外植体切口两端各滴加 2 μL 2 0 0 μmolL-1的AS ,可使Kanr 芽获得率达 13 3%.

根癌农杆菌对栝楼的遗传转化

用根癌农杆菌侵染栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim.) 无菌苗后,获得其冠瘿组织;栝楼冠瘿组织经除菌后能在无激素的MS培养基上良好生长,并合成冠瘿碱,表明Ti质粒转化成功。栝楼冠瘿组织中最高蛋白含量为130.6mg /g(鲜重)。经SDS-PAGE检测其含有的蛋白种类与栝楼根含有的基本一样。研究表明,利用栝楼冠瘿组织作为培养系统生产天花粉蛋白有很好的开发前景。

鸡志贺氏菌β-内酰胺酶的测定及其与耐药质粒的关系

通过对鸡志贺氏菌β-内酰胺酶及ESBLs的测定、质粒提取、细菌转化及质粒结合转移等试验,分析其耐药性与其质粒之间的关系,探讨耐药质粒在细菌间的传递方式.结果表明,质粒转化后的转化子对β-内酰胺类抗生素全部耐药,对氨基糖苷类、氟诺酮类有一定程度的敏感;而质粒接合传递体的耐药谱与质粒转化子一致.耐药菌株的质粒可编码β-内酰胺酶,且耐药质粒可通过结合转移方式传递至感受态大肠杆菌.

根癌农杆菌转化栝楼及植株再生

用根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)菌株C58感染栝楼 (TrichosantheskirilowiiMaxim .)无菌苗诱导冠瘿瘤 ,获得其冠瘿组织 ;栝楼冠瘿组织经除菌后能在无激素的MS培养基上良好生长 ,纸电泳检测结果表明其合成了冠瘿碱 ,表明Ti质粒转化成功。栝楼冠瘿组织在MS培养基上形成完整植株 ,移栽后良好生长。