重组pEGFP/Ang-1质粒转染兔骨髓基质干细胞及其表达的实验研究

目的 制备稳定高效表达血管生成素 1(Ang 1)的转基因工程骨髓基质干细胞。 方法 应用基因重组的方法构建Ang 1真核表达质粒 pEGFP/Ang 1,利用脂质体将 pEGFP/Ang 1转入骨髓基质干细胞 ,用流式细胞仪检测转染率 ,用荧光显微镜和免疫细胞化学方法检测蛋白质的表达。结果 质粒酶切电泳显示重组质粒构建成功 ,转染pEGFP/Ang 1质粒的骨髓基质干细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光 ;流式细胞仪检测转染率约 5 0 % ;免疫细胞化学检测可见转基因骨髓基质干细胞表达Ang 1蛋白。结论 成功制备表达外源性基因Ang 1的骨髓基质干细胞 ,制备方法是可行的。

脂质体介导pBLAST2-hHGF质粒转染Lewis大鼠肝卵圆细胞

背景:在体外将外源基因导入肝细胞相当困难,而利用肝脏干细胞导入外源性基因较为容易。目前大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立已较为成熟,但作为原代细胞,肝卵圆细胞的稳定培养和传代是较为困难的。目的:建立pBLAST2-hHGF质粒稳定转染大鼠肝卵圆细胞的细胞株,观察转染细胞的生物学特性。方法:取稳定培养的第4代雄性Lewis大鼠肝卵圆细胞,采用脂质体介导DNA转染的方法将pBLAST2-hHGF质粒转染到肝卵圆细胞,然后在倒置显微镜下观察转染细胞的形态变化、细胞增殖情况,检测细胞转染后的增殖分化能力,确定转染细胞的稳定培养条件,使用western blot和ELISA方法检测转染细胞hHGF蛋白的表达。结果与结论:第4代以脂质体介导成功转染pBLAST2-hHGF质粒的肝卵圆细胞在培养基中添加不同剂量和种类细胞因子的条件下转染细胞可稳定传代14代,其形态与未转染细胞比较无明显变化,但生长增殖速度明显快于未转染细胞,去除培养液中的生长因子后pBLAST2-Hhgf/肝卵圆细胞迅速分化为肝细胞和胆管上皮细胞,western blot方法检测转染细胞有hHGF蛋白表达,ELISA法检测培养液中hHGF蛋白含量高。结果提示,使用脂质体介导pBLAST2-hHGF质粒转染肝卵圆细胞方法可靠,转染细胞稳定培养并传代次数长于肝卵圆细胞,转染细胞具备分泌hHGF的能力,可用于后续研究。

比较不同频率低频超声联合微泡促进脂质体介导的pEGFP质粒转染人前列腺癌细胞的实验研究

目的比较不同频率低频超声联合微泡促进脂质体介导的p EGFP质粒转染人前列腺癌PC3细胞。方法实验共分7组:空白对照组仅人前列腺癌PC3细胞株,不进行任何处理;质粒组每毫升细胞悬液中加入1μg质粒;脂质体组每毫升细胞悬液中加入100μl转染液;脂质体+微泡组每毫升细胞中悬液加入100μl转染液和200μl微泡,低频超声联合脂质体+微泡组每毫升细胞悬液中加入100μl转染液和200μl微泡,同时采用声功率为400 m W/cm2的脉冲超声波辐照模式,辐照时间240 s,占空比设为1∶1,依据辐照频率不同又分3个亚组,分别为20 k Hz超声组、500 k Hz超声组和1 MHz超声组。每组设6个复孔。各组经处理后继续培养24 h,荧光显微镜观察转染情况;流式细胞仪检测各组转染率。结果荧光显微镜下,低频超声联合脂质体+微泡组PC3细胞胞质内可见大量绿色荧光蛋白表达,明显多于其他各组,各亚组间又以20 k Hz超声组绿色荧光蛋白较多;脂质体组和脂质体+微泡组绿色荧光蛋白表达量亦多于空白对照组和质粒组。流式细胞仪检测显示,低频超声联合脂质体微泡组转染率高于质粒组,其中20 k Hz超声组转染率最高,明显高于其他各组,差异有统计学意义(P<0.05)。脂质体组与脂质体+微泡组之间、500 k Hz超声组与1 MHz超声组之间转染率比较差异无统计学意义。结论低频超声辐照微泡可显著促进脂质体介导的p EGFP质粒转染人前列腺癌PC3细胞。在相同声功率、相同辐照面积下,随着辐照频率的升高,转染率呈现下降趋势。

VEGF重组质粒转染骨髓间充质干细胞及表达的检测

当细胞植入体内后,必须尽快发生血管化,建立血液循环,通过血液-细胞间液使细胞获得营养及氧气,维持其活力,进而发挥成骨作用,修复骨缺损。充分的血液供应是保证细胞在体内存活的决定性因素。在应用大块组织工程骨修复骨缺损时,

质粒转染对HEK293和DDT1-MF2细胞天然β2-肾上腺素受体表达的影响

目的 :观察质粒转染对细胞天然 β2 肾上腺素受体 (β2 AR)表达量的影响。方法 :将不携带外源目的基因的 pREP4质粒和携带α1B AR或 β1 ARcDNA的 pREP4质粒 ,采用脂质体和磷酸钙沉淀法转染HEK2 93和DDT1 MF2细胞。结果 :相同质粒载体 ,无论有无外源目的基因 ,或目的基因是否相同 ,均可使HEK2 93细胞天然表达的β2 AR密度及其介导的cAMP蓄积效应增加。而用同样方法在DDT1 MF2细胞转染 pREP4质粒则对 β2 AR表达无影响。结论 :转染携带或不携带目的基因的质粒对HEK2 93细胞天然表达 β2 AR的密度及其介导的功能效应均有影响 ,且提示这种效应可能具有细胞特异性。

针对HP450基因shRNA真核表达载体的质粒转染

目的以pGPH1/GFP/Neo质粒为载体,构建特异性针对HP450基因shRNA真核表达载体,并通过脂质体介导转染正常的大鼠肝细胞株(BRL),以探讨靶向干扰HP450基因对BRL细胞生长的影响。方法构建pGPH1/GFP/NeoHP450真核表达载体。应用脂质体转染技术,将重组的pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体转染至大鼠肝细胞株(BRL),并于转染后6、12、24 h在荧光倒置显微镜下观察细胞状态。结果成功构建针对HP450基因shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,通过脂质体介导转染大鼠肝细胞株BRL,在荧光倒置显微镜下可观察到细胞转染后的荧光现象。结论成功构建的HP450 shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,可通过质粒转染方法转染至BRL细胞。

人骨保护素质粒转染抑制大鼠实验性牙周炎骨吸收的研究

目的:将自行构建的质粒载体pcDNA3.1-hOPG,通过体内转染,评价OPG直接基因转染疗法对大鼠实验性牙周炎牙槽骨吸收的影响,为牙周炎以及种植体周炎的生物治疗提供实验依据。方法:将30只SD大鼠随机分为3组,即Ⅰ组生理盐水组(n=10,100μg/只)、Ⅱ组pcDNA3.1(-)组(n=10,100μg/只)、Ⅲ组pcDNA3.1-hOPG组(n=10,100μg/只)。通过丝线结扎、接种牙周炎可疑致病菌、喂高糖软食诱发实验性牙周炎。结扎28d后处死,通过大体标本、组织学等观察牙槽骨吸收、OPG及破骨细胞变化。结果:Ⅲ组结扎侧OPG表达强度增加,牙槽骨吸收量减少(P<0.05),活化破骨细胞数降低(P<0.05)。结论:OPG重组质粒转染,减少破骨细胞数量,有效减缓实验性牙周炎引起的牙槽骨吸收破坏。

粘着斑激酶相关非激酶质粒转染抑制肝星状细胞周期进程及机制研究

粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）磷酸化后，对多种类型细胞的生物学行为具有重要影响，如促进增殖，正性调控细胞周期，增强粘附、迁移，控制凋亡等。粘着斑激酶相关非激酶（FAK—related non-kinase，FRNK）是FAK的内源性抑制剂。本研究应用体外细胞培养技术，以纤维连接蛋白（fibronectin，FN）刺激肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）增殖，在脂质体介导下瞬时转染FRNK质粒，探讨选择性阻断FAK磷酸化对HSC增殖周期及细胞周期相关蛋白的影响。

iASPP基因siRNA质粒转染白血病细胞株后细胞凋亡的变化

ASPP家族成员抑制剂（inhibitory member of the ASPP family，iASPP）是最近发现的能特异抑制p53抑癌功能的蛋白。研究发现iASPP在多种肿瘤细胞中表达显著升高，提示通过抑制肿瘤细胞中iASPP基因的过表达有可能成为恢复p53抑癌功能的新策略。我们通过构建iASPP基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体，将其分别转染到含野生型p53和非野生型p53基因白血病细胞株中，检测其对iASPP基因的沉默作用以及细胞凋亡的变化情况，探讨白血病细胞p53的诱导细胞凋亡能力恢复的可能性，为p53的调控以及白血病的研究提供新的思路。

体内质粒转染后轴突再生示踪模型的研究与应用

近年来，再生相关基因（RAGs）以及表观遗传修饰对轴突再生的调控作用逐渐成为领域内的研究热点。我们在体内转染技术的基础上建立了绿色荧光蛋白（GFP）／目的基因质粒共转染的脊髓背根神经节（DRG）轴突示踪动物模型。

治疗性双质粒HBV DNA疫苗的体外转染表达与鉴定

目的:探讨治疗性双质粒HBVDNA疫苗转染COS-7细胞后目的基因的表达情况。方法:以脂质体转染试剂LipofectamineTM2000介导,将带有preS2+S基因的重组疫苗质粒pS2.S和带有hIL2+hIFNγ融合基因的重组佐剂质粒pFP分别转染COS-7细胞,同时设立空质粒转染和未转染细胞为对照组,于转染后24,48,72,96h采用ELISA法检测细胞培养上清的HBsAg、融合蛋白白细胞介素(IL-2)及干扰素(IFN-γ)的表达,并测定融合蛋白的IL-2、IFN-γ活性,采用ECLWesternblotting分析和鉴定目的蛋白preS2+S、IL-2及IFN-γ的分子质量大小。结果:双质粒在转染COS-7细胞后不同时间均可进行分泌表达,且48h时目的蛋白的表达量达峰值,其中表达的融合蛋白具有较高的IL-2和IFN-γ的生物学活性,pS2.S和pFP的转染上清分别在30.6ku和110ku处有特异性阳性反应条带。结论:HBVDNA疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pFP在COS-7细胞的最佳表达时间是转染后48h,并鉴定双质粒表达产物的分子质量大小分别为30.6ku和110ku。

弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB/P5-P3的构建

目的构建弓形虫P24(TgP24)基因敲除转染质粒pGB/P5P3(GRA2/BleP245’UTRP243,UTR),为TgP24基因敲除奠定基础。方法根据TgP24基因序列,设计并合成两对特异引物(P1toP4),采用PCR技术特异扩增TgP24基因的5,端非翻译区2.5kb片段(P245’UTR)和3’端非翻译区2.89kb片段(P243’UTR),将其分别亚克隆入pCR2.1TOPOTA载体,构建质粒P245’UTR/TA和P243’UTR/TA;重组质粒P245’UTR/TA经KpnⅠ和BglⅡ双酶切后,再将纯化的P245’UTR片段亚克隆入转染质粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ位点,构建重组质粒pGBP5(GRA2/BleP245’UTR);重组质粒P243’UTR/TA经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后,纯化P243’UTR片段,再将其定向克隆到重组质粒pGBP5的BamHⅠ和NotⅠ位点,从而构建弓形虫TgP24基因敲除转染质粒pGB/P5P3。重组质粒经DNA序列测定证实目的片段插入正确。结果经过PCR筛选、限制性酶切及DNA测序鉴定,证实P245’UTR和P243’UTR两片段正确插入质粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ及BamHⅠ和NotⅠ位点,位于药物选择ble基因的上,下游。结论成功构建弓形虫P24基因敲除转染质粒pGB/P5P3。

重组质粒pEGFP-N2/XPD转染条件及Pifithrin-α孵育条件的探索

目的探讨重组质粒pEGFP-N2/XPD的转染条件和Pifithrin-α（P53抑制剂）的孵育条件。方法利用脂质体将质粒pEGFP-N2/XPD在不同质粒浓度时转染细胞以及转染后分别孵育不同时间,然后进行RT-PCR和Western blot检测着色性干皮病基因D（XPD）的表达。将Pifithrin-α在不同浓度时孵育细胞以及分别孵育细胞不同时间,然后进行MTT检测。结果 XPD的表达在质粒浓度为0~4μg·孔-1范围内呈剂量依赖性升高（P〈0.01）,而质粒浓度达到4μg·孔-1以后XPD的表达不再随浓度的增加而继续升高;转染后细胞孵育时间为48h时XPD mRNA的表达为最高（P〈0.05）,转染后细胞孵育时间为72h时XPD蛋白的表达为最高（P〈0.01）。细胞增殖活力在Pifithrin-α浓度为0~20μmol·L-1范围内呈剂量依赖性升高（P〈0.05）,而Pifithrin-α浓度达到20μmol·L-1以后细胞增殖活力不再随浓度的增加而继续升高;细胞增殖活力在Pifithrin-α孵育时间为0~24h范围内呈时间依赖性升高（P〈0.01）,而Pifithrin-α孵育时间达到24h以后细胞增殖活力不再随孵育时间的增加而继续升高。结论在后续的研究中,将以浓度为4μg·孔-1的pEGFP-N2/XPD质粒转染HepG2.2.15细胞,转染后的第2天以浓度为20μmol·L-1的Pifithrin-α孵育细胞24h,转染后共孵育细胞48h。

转染NF-κB抑制物基因对食管癌细胞系生物活性的影响

目的:将NF-κB抑制物基因pcDNA3/mIκBαS32A/S36A转染食管癌细胞株EC1,观察对NF-κB因子活性及对细胞生长的影响。方法:采用脂质体转染法将pcDNA3/mIκBαS32A/S36A质粒转染入EC1细胞进行瞬时表达,检测其对EC1细胞的影响,用Westernblot和RT-PCR方法检测转染前后NF-κBp65、NF-κBp50蛋白和mRNA表达水平的变化。结果:与转染pcDNA3.0质粒和未转染质粒组比较,转染pcDNA3.0/mIκBαS32A/S36A质粒EC1细胞的生长速度受到明显抑制,P<0.05。转染pcDNA3/mIκBαS32A/S36A质粒的EC1细胞,在0、24、48、96小时未见NF-κBp65、NF-κBp50蛋白和mRNA表达,而转染pcDNA3.0质粒EC1细胞可见核内NF-κBp65和NF-κBp50蛋白表达。结论:转染NF-κB抑制物基因IκBα后可抑制EC1细胞的生长,并抑制细胞NF-κBp65、NF-κBp50基因的表达,该结果提示调节NF-κB的表达可能是食管癌基因治疗的靶点。

氯离子通道蛋白1的细胞转染定位

目的 利用重组的胞内氯离子通道蛋白CLIC 1蛋白的过表达来了解该蛋白质在细胞中的定位。方法 用免疫荧光的方法观察CLIC 1蛋白在细胞中的定位。结果 荧光显微镜观察表明CLIC 1蛋白虽然在细胞核中分布较为集中 ,在细胞质中也有相当的分布。结论 实验结果为进一步的了解CLIC

Schwann细胞转染Ha-Ras对 β_1 ,4-半乳糖基转移酶I,II,V表达的影响

目的 :研究原代Schwann细胞转染持续激活型原癌基因Ha Ras后β1,4 半乳糖基转移酶I,II ,V(β 1,4 galactosyltransferaseI ,II ,V ;β 1,4 GalT I,II,V)表达变化。方法 :构建Ha Ras表达质粒和分离纯化大鼠Schwann细胞 ,将Ha Ras表达质粒转染到Schwann细胞中。采用NorthernBlot方法分析转染细胞中Ha Ras转染情况和转染后β 1,4 GalT I,II,V的表达变化。结果 :原代Schwann细胞转染持续激活型Ha Ras后 ,β 1,4 GalT I随转染时间延长而表达增高 ,而 β 1,4 GalT II及V的表达无变化。 结论 :β 1,4 GalT I随Schwann细胞转染时间Ha Ras延长而表达增高 ,提示原代细胞表面的 β 1,4 GalT I可能与Ha Ras影响原代细胞增殖的信号途径相关。

磷酸钙转染方法的优化

通过比较293T细胞的接种密度、质粒DNA的量以及CO2浓度对磷酸钙转染方法的影响,确定最佳的转染条件.以各单因素试验的最适条件为依据,设计三因素三水平的正交试验.结果表明,磷酸钙介导质粒DNA转染,当293T细胞的接种密度为5×105/mL、质粒DNA的量为30μg、细胞培养环境CO2浓度为3%时,转染效果最佳.

GLP1R-GFP稳定转染Rin-m5F细胞系的构建

目的本研究目的是构建一种能稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)人胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的胰岛细胞系,用来筛选GLP1R激动剂类药物。方法使用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent将pCMV6-AC-GLP1R-GFP质粒转染到Rin-m5F细胞,经G418筛选单克隆Rinm5F/GLP1R-GFP细胞并扩大培养。结果该细胞能稳定传代,荧光显微镜下观察细胞绿色荧光分布均匀,Western blot验证GLP1R蛋白表达显著增加。在实验验证中,对照空白组中细胞绿色荧光分布均匀,阴性药物格列本脲(非GLP1R靶点药物)作用时细胞内无明显荧光斑点出现,阳性药物百泌达作用(GLP1R激动剂类药物)时细胞内出现显著荧光斑点。结论 GLP1R激动剂类药物筛选模型Rin-m5F/GLP1R-GFP成功构建。该模型能对混合物样品进行筛选,具有假阳性极低、筛选所需样本小、筛选样品量大、易标准化、筛选速度快、特异性强等优势,为GLP1R激动剂类药物的筛选奠定了基础。

三种转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞的比较研究

目的:采用不同转染试剂介导pGPU6/GFP/Neo质粒转染鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1,以获得最优化的方法。方法:分别采用不同剂量(1.25μl、2.0μl、2.5μl)的Lipofectamin2000、Gbfectene-Elite及HilyMax转染试剂介导1μg质粒进行转染,观察其转染效率,测定其转染细胞存活率。结果:HilyMax组的转染效率为(86.85%±2.32%),较Lipofectamin2000组(48.33%±3.24%)、Gbfectene-Elite组(37.35%±5.41%)高(F=18.882,P<0.05);其中,HilyMax 2.5μl组的转染效率最高为(90.53%±1.15%)。Lipofectamin2000组的细胞存活率(65.76%±5.78%)明显低于HilyMax组(89.54%±0.86%)、Gbfectene-Elite组(82.45%±3.56%)(F=90.676,P<0.05)。结论:HilyMax对于鸡胚成纤维细胞具有最好的转染效率和最低的细胞毒性,推荐使用2.5μl HilyMax:1μg质粒进行鸡胚成纤维细胞的转染。

水动力转染技术建造慢性乙型肝炎动物模型特效研究

目的比较不同质粒建立的水动力转染乙型肝炎小鼠模型的特性。方法将pc DNA 3.1-1.3-HBV-C与PAAV-1.2-HBV-A两种质粒通过水动力转染法建立两种乙型肝炎小鼠模型,通过对建模成功率和小鼠外周血HBs Ag滴度及稳定性,T细胞指数流式等检测分析,比较不同模型差异和特效。结果转染pc DNA3.1-1.3-HBV-C质粒建模成功率为78.6%,转染后体内HBs Ag滴度最高达到220IU/m L;转染PAAV-1.2-HBV-A质粒建模成功率为56%,转染后体内HBs Ag滴度最高达到2 300IU/m L。建模小鼠的肝脏进行切片,做免疫组化后,观察实验结果,转染pc DNA 3.1-1.3-HBV-C质粒的小鼠肝脏切片的HBs Ag免疫组化较PAAV-1.2-HBV-A质粒小鼠颜色面积更大。实验小鼠转染质粒后6周的外周血进行流式细胞术检测,结果显示特异性T细胞CD4+、CD8+和正常小鼠比较,两种质粒的造模小鼠未有差别。结论利用水动力转染法用不同质粒建造乙型肝炎小鼠模型在乙肝病毒指标水平和稳定性方面有着显著差异。