大黄鱼病原弧菌耐药质粒转移研究

用混合培养法进行耐药质粒从大肠杆菌 (Escherichiacoli)向病原弧菌转移研究 ,结果表明 ,耐药质粒 pBR322和 pBR325可以从大肠杆菌向病原弧菌转移。在混合培养30min后 ,部分弧菌获得耐药质粒 ,质粒的转化率随着培养时间的延长而增大 ;混合培养24h后 ,转化率分别提高至4.62×10-6～1.18×10-5。耐药质粒 pBR322和 pBR325在2株病原弧菌细胞内能较为稳定地遗传 ,在培养初期 (0～1h) ,均未出现质粒丢失 ,随着培养时间的延长 ,有少量细胞因丢失耐药质粒而表现出对药物的敏感性 ;培养72h后 ,质粒 pBR322和 pBR325在副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)中的丢失率分别为10 %和9% ,溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)中2种质粒的丢失率分别为22%和19 %。细菌的药敏试验表明不同菌株在获得耐药质粒后对特定药物的抗性大大增强 ,但不同菌株的耐药水平有所不同 ,说明耐药质粒在不同菌株中的表达水平有所不同。

枯草杆菌和乳链球菌间质粒转移

往复性质粒PGK_(12)以及几种金黄色葡萄球菌质粒通过与枯草杆菌属间原生质体融合而引入到乳链球菌中,金黄色葡萄球菌质粒乳链球菌是稳定遗传的,所以,它们完全可以在乳链球菌中用作无性系载体。

亚抑菌浓度万古霉素对质粒接合转移的促进作用

为了分析亚抑菌浓度万古霉素对质粒接合转移的影响,本试验建立了以大肠杆菌(E.coli)J53作为受体菌,携带RP4-7质粒的E.coli DH5α和携带mcr-1阳性IncI2质粒的临床菌株E.coli LD67-1为供体菌的接合转移模型,测定亚抑菌浓度的万古霉素对接合转移的影响,并通过细胞膜通透性检测、扫描电子显微镜观察、活性氧(ROS)检测和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法探究其内在机制。结果显示,与空白对照组相比,亚抑菌浓度万古霉素可显著提高RP4-7质粒和mcr-1阳性IncI2质粒的接合转移频率(P<0.05);N-苯基-1-萘胺(NPN)和碘化丙啶(PI)探针检测显示,亚抑菌浓度万古霉素可使受体菌细胞内、外膜通透性增加,供体菌细胞外膜通透性增加;扫描电子显微镜观察显示,经1/4最小抑菌浓度(MIC)万古霉素处理后接合细菌细胞膜发生损伤;ROS检测结果显示,与空白对照组相比,虽然经1/4 MIC万古霉素处理的受体菌的ROS表达水平显著上调(P<0.05),但1/8 MIC万古霉素处理后,供体菌和受体菌的ROS水平均无显著变化(P>0.05);RT-qPCR结果显示,与空白对照组相比,亚抑菌浓度万古霉素显著上调了供体菌和受体菌的孔蛋白基因ompF和ompC的mRNA表达水平(P<0.05),极显著上调了trbBp基因(调控细菌间形成“连接桥”)的mRNA表达水平(P<0.01),显著上调了细菌SOS响应(SOS response)相关基因recA、recN、ruvA和lexA的mRNA表达水平(P<0.05)。结果表明,亚抑菌浓度的万古霉素可能通过提高细菌细胞膜通透性,触发SOS响应,促进接合转移“连接桥”形成等方式促进RP4-7质粒和mcr-1阳性IncI2质粒的接合转移过程。

细菌耐药性扩散与R质粒的转移研究

我们于１９９５年１０月至１９９７年１０月对细菌质粒的存在和流向以及对微生物的影响进行了初步研究，探讨质粒在微生态方面的作用。本文通过对大肠杆菌、鼠伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌及奈瑟淋球菌Ｒ质粒的存在及转移的研究，探讨Ｒ质粒与微生态的关系。材料与方法（１）...

红谷霉素对细菌耐药性质粒转移的抑制作用

以Shigella flexneri D15 R-plasmid CmR和Escherichia coil 1485 RifR为试验菌株,研究红谷霉素对细菌耐药性质粒在细菌之间转移的抑制作用及对两种细菌R质粒的消除作用.将红谷霉素(30μg/mL)与S.flexneri D15 R-plasmid CmR和E.coli 1485 RifR按实验设计混合并分别培养24 h和48 h,涂布在麦康凯琼脂平板上,计算相应菌落数.结果表明,当红谷霉素抑菌浓度为30μg/mL时,对细菌耐氯霉素的R质粒的转移抑制率分别达到92.82%(24 h培养)和96.04%(48 h培养),但对R质粒的消除作用不显著.说明红谷霉素对R质粒转移抑制作用强烈但不具有R质粒的消除作用.

农药降解质粒向根瘤菌的转移

研究了细菌农药降解质粒P^(JP4)向根瘤菌的转移以及农药降解质粒引入根瘤菌后,对其共生性、固氮能力和根瘤结构的影响。结果表明,三种根瘤菌受体均接受了农药2,4-D降解质粒P^(JP4)。转移频率在4.0×10^(-6)—6.4×10^(-6)之间。其中一个受体菌株在灭菌土壤中接受该质粒,其转移频率为5.1×10^(-7)。接受了农药降解质粒的接合子保持了根瘤菌的共生性状、乙炔还原活性,所形成的根瘤结构与亲本株没有明显差别。从根瘤中分离的接合子仍保持了质粒P^(JP4)。

表达NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体的构建

将新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因1700bp克隆到真核表达载体pIRES中,构建成表达F基因的载体pIRESF,然后将包含F基因及其上游的内含子和下游的polyA的2900bpDNA片段再克隆入包含gB启动子的SK载体中,并使其克隆到gB启动子600bp的下游,最后将包含gB启动子和F基因表达盒3500bp克隆到包含MDVCVI988非必须片段US10的载体SK中。该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的MDVCVI988重组病毒奠定了基础。

杆状病毒双基因表达载体转移质粒的构建

杆状病毒载体系统的建立和发展,是80年代真核基因表达研究领域的重大进展之一。为了弥补用传统的杆状病毒载体系统重组的病毒只能经注射感染幼虫的不足,我们构建了能将外源基因和多角体蛋白基因同时插入杆状病毒基因组中的转移载体质粒pSXIVVI^+X3系列,建立起除能保留传统系统高效表达外源基因的特点外,还具有包含体,能以口服方式大规模感染粉纹夜蛾(Tricoplusia ni)幼虫的杆状病毒载体体系。本文报道以上述质粒为基础的杆状病毒双基因表达载体转移质粒的构建。

介导大鼠结缔组织生长因子基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的:构建介导大鼠结缔组织生长因子(CTGF)基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法:以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果:CTGF的短发夹RNA(shRNA)片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4个插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论:构建了能够表达4个含CTGF靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导CTGF基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。

新城疫病毒F_(48)E_9株病毒F基因表达盒的火鸡疱疹病毒转移质粒载体构建

将新城疫病毒 (NDV)F4 8E9株融合蛋白 (F)基因 170 0bp克隆到真核表达载体 pcDNA3 中 ,构建成表达F基因的载体 pc3F。然后将包含F基因及其上游的细胞巨化病毒启动子和增强子的 3 80 0bpDNA片段再克隆入包含火鸡疱疹病毒 (HVT)非必须片段载体 pTK2 B中 ,构建成功含有F基因表达盒的HVT转移质粒载体 pTK3 F。经限制性内切酶酶切分析 ,F基因表达盒的插入方向与pTK2 B中TK基因转录方向一致。

人乳头瘤病毒16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒的构建及鉴定

目的 :构建人乳头瘤病毒 16型与 11型 L 1基因双价重组杆状病毒转移质粒并对其进行鉴定。方法 :采用 PCR法从尖锐湿疣组织标本中扩增人乳头瘤病毒 11型晚期基因 L 1,并对其进行克隆测序 ;利用基因重组技术将人乳头瘤病毒 16型和 11型 L 1晚期基因共同装入杆状病毒转移载体中 ,分别位于强启动子 Ppolh和弱启动子 P10之下 ;利用酶切和 PCR技术对双价重组杆状病毒转移质粒进行鉴定。结果 :PCR扩增法获得尖税湿疣组织中感染的人乳头瘤病毒 11型的 L1基因 ,得到人乳头瘤病毒 16型 L1和 11型 L1基因双价重组杆状病毒转移质粒 ,经酶切电泳鉴定验证重组成功。结论 :本研究成功构建了双价重组杆状病毒转移质粒 ,为进一步构建双价 L 1蛋白表达系统进而建立双价基因工程亚单位疫苗打下基础。

含LacZ报告基因的传染性喉气管炎病毒TK基因转移载体质粒的构建

在传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）北京Ｅ２株ＴＫ基因克隆、鉴定的基础上［１］，进一步构建转移载体质粒，为ＩＬＴＶＴＫ基因缺失毒株的构建作准备，先用ＰｓｔＩ将ｐＳＶｇａｌ线性化，再经ＥｃｏＲＩ不完全酶切，分离含ＳＶ４０立即早期启动子和增强子的４２Ｋｂ的ＬａｃＺ报告基因片段，并用Ｋｌｅｎｏｗ大片段补平，将克隆ＴＫ基因的载体ｐＴＫ用ＳｎａＢＩ处理，后用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将以上两个片段平端连接成重组质粒，转化ＪＭ１０９，在Ｘｇａｌ、ＩＰＴＧ、Ａｍｐ、ＬＢ平板上筛选蓝色菌落，经琼脂糖凝胶电泳筛选到１２个阳性重组子，命名为ｐＰＴＫ，用ｐｓｔＩ和ＨｉｎｄＩＩ单酶切都得到了分子量为８１３Ｋｂ的质粒，进一步用狄高辛标记ＬａｃＺ基因片段作探针对ｐＰＴＫ进行打点杂交，结果均成阳性，证明了ＬａｃＺ基因已插入了ｐＴＫ，脂质体转染法也得到了蓝斑病毒，结果表明我们已成功构建了转移载体质粒ｐＰＴＫ。

AcNPV转移质粒与家蚕NPV杂交重组并在家蚕幼虫和蛹中表达及表达产物稳定性的研究

本文报道了含β-半乳糖苷酶基因的AcNPV转移质粒与家蚕NPV杂交重组并在家蚕幼虫及蛹体中进行表达的结果。在家蚕幼虫、蛹体中表达产物的量比在B_mN细胞中高100倍以上,每毫升血淋巴液中表达产物可达4mg。同时还研究了表达产物在血淋巴液中的稳定性以及体液中的蛋白酶抑制剂随NPV的复制而增加的特性,获得了具有指导生产意义的结果,并扩大了AcNPV转移质粒的应用范围。

含NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体的真核表达

为进一步提高重组病毒的表达水平,用构建的含gB启动子和NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体pUS10F转染293T细胞,通过PCR和接免疫荧光(IFA)法研究了其在真核中的表达,并确定最佳的转染条件。结果表明,真核细胞中带有F基因,转移质粒载体已经进入细胞DNA;转染转移质粒载体 pUS10F后的293 T细胞所表达的NDV F基因产物抗原性较好,能够与抗NDV的标准血清反应。确定的最佳转染条件为:DNA 3μg／mL,转染后48 h外源基因在细胞中的表达量最高,在6孔板和96孔板中细胞数量分别以 2×105／孔和1×101／孔的转染效果最好。

山东省部分志贺氏菌R质粒接合转移的研究

志贺氏菌属耐药菌株的不断增加,给细菌性痢疾的防治工作带来了一定的困难。耐药菌株中的一部分菌株耐药受可转移性耐药质粒(R质粒)控制。为了解山东省志贺氏菌耐药情况及R质粒接合转移率,我们对由腹泻病人分离的222株志贺氏菌进行了常用抗菌药物敏感性测定并对其中的67株耐药菌株作了R质粒接合转移实验,结果报告如下:

亚抑菌浓度环丙沙星对大肠埃希菌喹诺酮类耐药质粒接合转移的影响

目的探讨亚抑菌浓度环丙沙星对大肠埃希菌喹诺酮类耐药质粒接合转移的影响。方法采用PCR法筛选含有质粒介导的喹诺酮类耐药基因[包括qnr A、qnr B、qnr C、aac(6')-Ib-c基因]的大肠埃希菌作为供体菌;质粒接合试验分析喹诺酮类耐药质粒的接合转移能力;不同亚抑菌浓度的环丙沙星处理供体菌后,观察喹诺酮类耐药质粒接合效率的改变。结果 16株供体菌携带质粒介导的喹诺酮类耐药基因,其中6株供体菌携带的喹诺酮类耐药质粒可以接合转移,接合效率为2.6×10-2~1.2×10-1;接合效率最高的1株供体菌经不同亚抑菌浓度的环丙沙星处理后,其接合效率最高可较无环丙沙星处理组增加1.5倍。结论亚抑菌浓度的环丙沙星可以促进大肠埃希菌喹诺酮类耐药质粒的接合转移。

豌豆根瘤菌共生质粒pJB5JI对费氏中华根瘤菌共生固氮作用的影响

通过两亲本接合转移,将豌豆根瘤菌T83K3共生质粒pJB5JI转入费氏中华根瘤菌HN01及其质粒缺失突变株中,获得8个转移接合子,其中受体为HN01和pSfrHN01a缺失突变株HND28的接合子能够在大豆上形成有效根瘤,无论是人工传代还是与植物共生,外源质粒pJB5JI与受体菌内源质粒均能稳定存在,但不能在豌豆上结瘤,与大豆共生固氮能力和竞争结瘤能力与受体菌亲本相比没有明显变化.消除共生质粒的突变株HND29和共生质粒与pSfrHN01a质粒均消除的突变株HND100作受体菌的接合子,既不能在大豆上结瘤,也不能在豌豆上结瘤.研究结果表明,pJB5JI与HN01的3个质粒属于不同的不相容群.pJB5JI在HN01中的表达功能可能受到受体菌的共生质粒和染色体基因的共同影响.

通过胚电泳转移基因

美国农业部花卉与苗圃作物实验室的 R.J.Griesbach 开发了一种直接把基因转移给植物的新方法。此方法是将植物胚顶端的分生组织暴露在有电场的外源 DNA 里,把含有0.3%琼脂糖的吸管和含有 DNA的乙酸缓冲液置于带顶端分生组织的胚一端,而另一端与仅含缓冲液和琼脂糖的吸管连接,通过电流而产生 DNA 摄取。Griesbach 利用这种胚电泳系统把含有 GUS 标记基因的质粒转移到了虾脊兰胚的顶端分生组织里,

1984年度国际细菌质粒会议在美国举行

1984年5月14日至5月18日在美国伊利诺斯州厄巴拉举行这次学术讨论会。这次会议特邀请世界各国从事这方面研究的著名科学家,其中有美国、英国、苏联、瑞士、西德、日本、法国、荷兰、中国、瑞典、以色列、苏格兰、澳大利亚、比利时等国家的学者出席。会议进程:头一天全体大会(主席I.G.Gunsalus,英国)。

抗铅联合苯酚降解多功能菌的构建

采用质粒消除技术对Pb抗性菌和高效酚降解菌的抗铅降酚基因进行定位,提取高效酚降解菌降解质粒,将其转化到Pb抗性菌中进行遗传重组,研究多功能菌在重金属铅与酚类物质同时存在的体系中污染物质去除转化能力,同时研究抗重金属铅联合酚降解转化菌株中转化质粒的存在情况。结果表明抗铅菌株的抗铅功能与质粒存在无关,而高效降酚菌降酚基因位于质粒上;获得了降酚抗铅转化子,经驯化筛选出的转化子在铅浓度100mg.L-1时可将500 mg.L-1苯酚降解率达到95%以上,说明构建的抗铅降酚工程菌铅具抗性具降解苯酚功能。经分子验证,高效降酚菌的质粒DNA已经进入抗铅菌体内,并得到一定表达。