pEGFP-N1-TNFα表达载体的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础。方法以pMD19Sim-ple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFαCDS区片段,将PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFα的PCR片段及目的载体pEGFP-N1双酶切,然后进行连接。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果 PCR扩增片段、双酶切出现722bp大小的目的基因条带与预期结果相符;插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-TNFα,为下一步用纳米材料转染CIK细胞的研究奠定了基础。

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。

猪瘟病毒NS4B真核表达载体的构建与表达

猪瘟病毒NS4B蛋白是猪瘟病毒编码的一个非结构蛋白,由347个氨基酸残基组成。NS4B在病毒中可能与致细胞病变有关,具体功能尚不清楚。本试验利用PCR扩增NS4B基因,利用双酶切、连接和转化等操作方法,与质粒载体p EGFP-N3构建成真核表达重组质粒,双酶切检测猪瘟病毒NS4B真核表达载体构建成功。测定重组质粒序列,并验证表达成功,为今后的功能研究奠定了基础。

H5N1亚型禽流感病毒ns1基因修饰

目的:对H5N1亚型禽流感病毒株(A Qa ST85201)的ns1基因进行修饰并构建ns1基因的真核表达载体。方法:用RT PCR方法扩增A Qa ST85201的ns1基因,之后以扩增产物为模板,采用多重PCR技术对ns1基因进行修饰,将缺失的15个核苷酸片段插入ns1基因中,并将其克隆到真核表达载体,构建pcDNA3.1ns1重组质粒。结果:RT PCR产物测序显示,A Qa ST85201ns1基因开放阅读框全长678bp,编码225个氨基酸。构建的重组质粒经酶切鉴定和序列测定与预期相一致。结论:成功将缺失的15个核苷酸片段引入A Qa ST85201的ns1基因中,重组质粒的构建为NS1蛋白功能研究奠定了基础。

小鼠Oct4基因克隆及其真核表达载体的构建

背景:Oct4是第一个被发现只在多能细胞中表达的转录因子,其功能被认为是控制细胞多能性的决定性因素。Oct4的这种作用机制目前并未明确。目的:克隆小鼠Oct4基因,构建其真核表达载体pEGFP-N2-Oct4。设计、时间及地点:单一样本研究,于2007-06/09在江西省分子医学重点实验室完成。材料:TRIzolReagent由MolecularRearchCenterInc提供;真核表达质粒载体pEGFP-N2由南昌大学第二附属医院分子医学重点实验室提供。方法:用TRIzolReagent提取小鼠胚胎干细胞总RNA,并经反转录-聚合酶链反应获得小鼠Oct4DNA,将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N2上,以构建重组质粒pEGFP-N2-Oct4。主要观察指标:总RNA鉴定结果,RT-PCR扩增产物小鼠Oct4分子质量的鉴定结果,重组表达载体的酶切鉴定结果,克隆质粒的测序结果。结果:获取小鼠胚胎干细胞Oct4基因的全序列cDNA。构建Oct4cDNA真核表达质粒时,将增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在Oct4基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实。结论:构建重组质粒pEGFP-N2-Oct4成功,将增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在Oct4基因的3'端,即保留了Oct4的生物学活性,又便于在研究Oct4生物学功能实验中可检测到蛋白表达。