质粒DNA Fast NGS测序方法的开发和应用

质粒DNA是最常用的基因运载工具,在基因合成技术中扮演着至关重要的角色。如何实现合成质粒DNA的准确且快速检测,是确保基因组完整性和提高基因合成效率的关键。尽管基于一代DNA的测序方法,其准确性已成为行业标准,但在检测通量、检测速度和检测成本等方面仍然存在局限性,这促使科学家们不断寻求新的解决方案。基于生物酶库,开发了DNA建库酶TN5,建立了高通量质粒DNA检测方案——Fast NGS。利用不同长度、不同质量的质粒DNA样本评估了Fast NGS的可行性,并对质粒DNA样本进行了高通量测序,最后对比了Fast NGS与Sanger测序的效率。结果表明,DNA建库酶TN5蛋白的纯度和质量符合二代测序要求。Fast NGS适用于3~8 kb基因合成质粒的测序检测,其检测通量高达2500个·12 h-1,测序成功率超过95%,测序准确性与一代测序相当,并且无明显序列偏好性。Fast NGS实现了质粒DNA的高通量、快速且低成本检测,为基因合成技术的发展提供了新的方向。

电穿孔介导质粒DNA肿瘤内转移抑制恶性肿瘤生长与转移

利用携带绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)编码基因的表达质粒 ,测试电穿孔方法介导目的基因活体组织内转移的效率并优化电击参数 .在此基础上采用电穿孔技术直接将编码白介素 12 (IL 12 )、白介素 2 (IL 2 )、粒单细胞克隆刺激因子 (GM CSF)等免疫调节因子或反义血管内皮细胞生长因子 12 1(VEGF12 1)、可溶性血管内皮细胞膜受体 (sFlk 1及ExTek)等血管生成抑制因子表达质粒转移至肿瘤局部 .实验结果表明电穿孔介导GFP表达质粒肌肉内转移的效率较高 ,GFP可在肌细胞内持续高水平表达 3周以上 ,而在肿瘤细胞内只能表达 4～ 6d ,但高电压短脉冲电击组肿瘤内GFP阳性细胞数比低电压长脉冲组高 2 6 8倍 .多次电击介导IL 12表达质粒转移至肿瘤组织内 ,可有效地抑制小鼠膀胱癌BTT gfp、人乳腺癌MCF 7及肝癌SMMC 772 1 gfp的生长 .MCF 7对血管生成抑制因子基因转移治疗较敏感 ,单独应用反义VEGF12 1、sFlk 1或ExTek即显示明确的治疗效果 .SMMC 772 1 gfp单独应用sFlk 1有效 .小鼠膀胱癌对单独应用反义VEGF12 1、sFlk 1或ExTek治疗效果不理想 ,但联合应用sFlk 1和ExTek仍然可以有效地抑制肿瘤生长与转移 ,甚至使肿瘤缩小或消失 .提示电穿孔技术是一项高效、安全。

质粒DNA的阴离子交换色谱法纯化及内毒素去除

采用Fractogel(EMD TMAE(M)强阴离子交换介质分离纯化质粒脱氧核糖核酸(DNA),该介质对质粒DNA的动态载样量达0.62mg/mL。用Triton X-114或Triton X-100预先处理质粒DNA的裂解澄清液后,经阴离子交换色谱分离纯化获得的质粒DNA中内毒素含量分别为6.42EU/mg和9.50EU/mg,显著低于未经Triton处理的裂解澄清液(67.82EU/mg)。该法实现了阴离子交换色谱一步纯化质粒DNA的目的,具有简便、省时、成本低等特点。

改善大分子质粒DNA重组效率的新方法

采用两次连接法对一个质粒载体为 7 65kb ,插入子为 1 4 7kb的片段进行重组连接 ,使连接效率大大提高 .此方法对于大分子的质粒DNA重组是非常有效的 .

快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板

发展了一个利用煮沸法快速制备酵母质粒和基因组DNAPCR模板的程序 。

碱裂解法提取质粒DNA的研究

对质粒DNA及其结构、形态和功能进行了综述 ,介绍了碱裂解法提取质粒DNA的基本步骤 ,并对其提取过程中的注意事项进行了剖析 。

一种适合芽孢杆菌质粒DNA提取的改良碱裂解法

以Birnboim和Doly的质粒提取方法为基础 ,通过缩短菌体培养时间 ,增加菌体收集量 ,并对提取过程中所用的三种主要溶液的用量进行适当调整等 ,摸索出质粒提取的一种改良碱法 .用改良后的碱法对浸麻芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌进行质粒提取 。

基于质粒DNA匹配问题的分子算法

给定无向图 ,图的最小极大匹配问题是寻找每条边都不相邻的最大集中的最小者 ,这个问题是著名的NP 完全问题 .1994年Adleman博士首次提出用DNA计算解决NP 完全问题 ,以编码的DNA序列为运算对象 ,通过分子生物学的运算操作解决复杂的数学难题 ,使得NP 完全问题的求解可能得到解决 .提出了基于质粒DNA的无向图的最大匹配问题的DNA分子生物算法 ,通过限制性内切酶的酶切和凝胶电泳完成解的产生和最终接的分离 ,依据分子生物学的实验手段 。

营养条件对pcDNA3-HBS质粒DNA生产的影响

为了考查营养条件对质粒DNA的生产影响 ,采用不同的培养基培养含pcDNA33 HBS质粒的大肠杆菌JM10 9。实验结果表明 :碳源、氮源对质粒DNA产量有明显的影响。葡萄糖是质粒合成过程中较佳的碳源 ,蛋白胨是较佳的氮源。在M9P培养基中 ,选择合适的硫酸铵浓度对质粒DNA的生产有一定的作用。由于Gly ,Asp ,Glu能提供合成核苷酸的氮源 ,在M9G培养基中添加 1 2g L的Asp ,1 0g L的Glu和 0 4g L的Gly后 ,经 2 0h培养 ,质粒产量可达 2 5mg L。外源核苷也影响质粒DNA的产量 ,通过添加 0 4g L胞苷与胸苷的混合物 (摩尔比为 1∶1)到M9P培养基中 ,质粒DNA的产量可达 35mg L。

质粒DNA小量提取法的改进

介绍了一种改进的小量提取质粒DNA的方法,该方法用NH4Ac和LiCl代替常规方法中苯酚和氯仿的抽提,有效去除了样品中RNA和蛋白质;用95%乙醇代替无水乙醇沉淀质粒DNA,降低了终产物中盐和多糖等杂质的含量,获得的质粒DNA质量好,产率高,能满足常规分子生物学实验的要求,如PCR、酶切、转化大肠杆菌以及植物遗传转化.

数字PCR方法准确测量质粒DNA拷贝浓度

中国计量科学研究院(NIM)利用数字PCR技术针对国际比对样品质粒DNA,通过设计2对特异性的引物和探针、优化PCR扩增体系、排除PCR mastermix中的DNA污染,成功建立了定量该质粒DNA的数字PCR方法。比较了采用单重PCR和双重PCR方法定量结果之间的差异,最终实现了对比对样品的定量和不确定度评定。对线性质粒样品的测量结果及其扩展不确定度(k=2)为(8.06±0.55)×10~3 copies/nag,该结果在比对参考值不确定度范围内,且与参考值非常接近。

农杆菌质粒DNA提取方法的改良与鉴定

常规的农杆菌质粒DNA提取常采用碱裂解和酚、氯仿提纯方法 ,得率较低 ,一般在 5 0ng μl以下。针对常规碱裂解法的不足 ,利用含有pCGⅡ双价载体的LBA4 4 0 4菌株通过增加菌液收集量、改变提取流程中的反应条件等对常规方法进行了改良 ,去除了酚、氯仿提纯过程 ,减少了提取过程对人体的伤害 ,得率一般在 0 .5～ 2 μg μl。所提取质粒DNA可直接用于PCR。

碱裂解法提取细菌质粒DNA的改良

碱裂解法是目前最为广泛应用的细菌质粒DNA的提取方法。但该法提取DNA所需时间较长,通常需要2h以上。为了快速提取质粒DNA,对常规碱裂法中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、RNA酶A及无水乙醇的反应时间由原来的5min、5min、10min、30min、10min分别缩短至5s、1min、5s、10min、5min。这种改良方法极大地缩短了DNA的提取时间,可在30min内完成整个DNA的制备,且制备的DNA可直接应用于进一步的酶切、连接及PCR等各种分子生物学分析。

DNA分子结构的多态性研究 (Ⅱ) 吖啶橙凝聚体变化诱导的质粒DNA大分子构象的研究

利用吸收光谱和荧光光谱方法，研究了吖啶橙（ＡＯ）与质粒ＤＮＡ水溶液、以及含胶束介质的吖啶橙与质粒ＤＮＡ溶液体系的相互结合作用及减色效应。结果表明：吖啶橙对质粒ＤＮＡ的吸收光谱有减色效应；含十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）的ＡＯ水溶液体系中，随着ＳＤＳ浓度的增加，其光谱结果表现为由凝聚态向单体的转化。而在含十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）的ＡＯ与质粒ＤＮＡ溶液体系中，吖啶橙凝聚态随ＳＤＳ浓度的增加，对ＡＯ与质粒ＤＮＡ相互结合产生协同的减色效应，使质粒ＤＮＡ空间结构发生缩拢。进一步采用电泳法研究了ＡＯ凝聚态可能对质粒ＤＮＡ构象的影响，结果表明：在ＡＯ与质粒ＤＮＡ溶液体系中，ＡＯ浓度的增加对质粒ＤＮＡ构象未产生影响；而在含有ＳＤＳ的ＡＯ与质粒ＤＮＡ的溶液体系中，由于ＳＤＳ对ＡＯ凝聚态的解聚作用，以及ＳＤＳ对质粒ＤＮＡ减色效应的协同作用，使得质粒ＤＮＡ的构象发生变化。

GFP质粒DNA/阳离子脂质体复合物的制备及其体外表达

目的 为基因免疫和基因治疗寻找一种简单、经济、有效的 DNA投递系统。方法 采用逆向蒸发法 ,用卵磷脂、胆固醇、十八胺制备成阳离子脂质体包封含绿色荧光蛋白基因的真核表达质粒 p EGFPC1,对三种不同DNA加入量所形成的 DNA/脂质体复合物的微球形、包封率、电荷性、转染真核细胞的效果以及对细胞的毒性作用进行初步检测研究。结果 所获得的 DNA/脂质体复合物呈球形、平均粒径为 5 6 2 nm;包封率达 5 5 %～ 6 5 % ,为阳离子脂质体 ;都能有效转染真核细胞 ,但转染效率有差异 ,DNA/脂质体混悬液中 DNA含量、混悬液的加入量以及细胞的作用时间 ,都对细胞毒性有不同程度的影响。结论 该方法可作为提高基因免疫效果的简单、经济。

一种简便快捷的植物线粒体质粒DNA的提取方法

介绍了一种从植物材料中提取线粒体质粒 DNA的方法 ,该方法不需要密度梯度离心和有机溶剂抽提 ,整个提取过程可在较短时间内完成 .该方法简便、快捷、效果好 ,对拷贝数低的线粒体质粒

治疗用质粒DNA的纯化工艺

目的探索适合大规模生产治疗用质粒DNA的纯化工艺。方法采用中空纤维柱收菌、碱裂解,再应用中空纤维柱浓缩质粒,经分子筛、亲和、离子交换等层析分离纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、PCR、核酸蛋白检测仪、BCA蛋白检测试剂盒和内毒素检测试剂盒对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果所获得的超螺旋质粒DNA达到样品总质粒的91.2%;质粒DNA总纯度为1.8;内毒素含量小于10EU/mg;几乎检测不到蛋白质残留,未检出基因组DNA残留。各项指标均符合有关质量标准。结论所采用的纯化工艺省时省力,制备的质粒DNA纯度高,适用于大规模生产治疗用质粒DNA。

一种改良式质粒DNA提取方法的建立与应用

目的建立一种稳定、可靠的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值。方法将含有目的质粒的菌株扩增后,运用改良后的碱裂解法进行质粒DNA小量提取,微量核酸仪测定提取质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、内切酶酶切及质粒转染真核细胞鉴定提取质粒DNA的质量及转染效率。结果改良式质粒提取方法获得质粒DNA产量为3.2 mg/L菌液,A260/280=1.91;内切酶酶切完全;质粒DNA以超螺旋结构为主;真核细胞转染效率为20%左右。结论改良式质粒DNA抽提方法操作简单、实用,获得质粒DNA产量多、质量高,能达到分子生物学常规实验的要求。

低分子量壳聚糖及其水溶性衍生物对质粒DNA和mRNA的影响

研究了低分子量壳聚糖及其O-羧甲基壳聚糖和O-羟乙基壳聚糖在不同质量分数和作用时间下,对大肠杆菌质粒DNA(pBR322和pUC18)的体外结合能力。研究结果表明,原料壳聚糖对2种质粒都有较强而稳定的结合能力;其2种衍生物对质粒的作用效果受空间位阻效应和氨基基团数量的共同影响,在适当的质量分数(≥1×10-2)和相对分子质量(2000,5000,8000及以上)的条件下,对质粒DNA都具有很强的结合能力。研究表明,壳聚糖及其衍生物对DNA的结合是基于正负电荷的静电吸引作用,结合过程短暂,结合能力不受作用时间的影响。相对分子质量为3000～5000的原料壳聚糖和O-羧甲基壳聚糖均可以有效阻碍mRNA的复制,且O-羧甲基壳聚糖在同等条件下影响作用较大,推测是由于此种衍生物对氨基的质子化能力较大和体积庞大造成。大肠杆菌体内转化实验表明,壳聚糖和O-羧甲基壳聚糖不仅可以和DNA结合而使之不能转化,而且可以直接阻碍正常质粒DNA向大肠杆菌的转化过程。

双歧杆菌的药敏性及其质粒DNA的检测

利用药敏纸片琼脂扩散法检测了10株具有粘附性的双歧杆菌对临床常用的12大类38种抗菌药物的药敏性。结果显示,对于同一菌株,其对同类抗菌药物表现出基本一致的药物敏感性;不同菌株间在对于同一类药物的敏感性上也有着较好的吻合,如对青霉素类、喹诺酮类、氨基糖甙类及多肽类的表现几乎全为耐药,对头孢类、大环内酯类、磺胺、氯霉素、克林霉素则基本表现为敏感。但在此基础上,不同来源的菌株间也存在着一定的差异。采用碱裂解法提取并检测了受试双歧杆菌的耐药性质粒,仅在一株受试双歧杆菌H-3中发现有1条质粒带,其对应的核酸分子量参照在5148～21226bps之间,其他受试菌株中未发现有质粒存在。