用pB1uescript SK(+)质粒自制T-A载体对DD RT-PCR产物进行克隆

ｍＲＮＡ差异显示技术可以显示ｍＲｗａ表达水平的差异。为了对用ｍｎｗＡ差异显示技术得到的差异条带进行研究，该文用改良碱裂解法抽提ｐＢＳ质粒，用ＥＣＯＲＶ将ｐＢＳ切成平头，利用ＴａｑＤＮａ聚合酶的非模板依赖性，在ｄｒｙＰ存在的条件下，用切成平头的ＰＢＳ质粒自制了Ｔ—Ａ克隆载体，对用ｍＲＮＡ差异显示方法得到的差异条带进行了重组，结果表明：用自制Ｔ一Ａ克隆载体对ＰＣＲ产物进行克隆的连接率较高，自制Ｔ一Ａ载体进行ＰＣＲ产物克隆是一简便可行的方法。

禽传染性支气管炎病毒S1基因植物表达载体的构建

:以含传染性支气管炎病毒 ( ZJ971毒株 ) S1基因的质粒 PBS为模板 ,根据其序列设计引物进行PCR扩增 ,得到 1.7kb左右的 S1基因产物 ;用 Xbal I和 Bam HI酶切纯化 ,并在 T4 DNA连接酶的作用下 ,定向克隆到植物表达载体 PBI12 1中 ,PCR及酶切鉴定表明 。

CD147-shRNA对肝癌细胞CD147表达的抑制作用

目的构建CD147-shRNA重组质粒并检测其对肝癌细胞SMMC-7721和HepG2内源性CD147表达的抑制作用。方法根据Genebank中CD147序列设计3条特征性靶序列,合成的核苷酸序列连接到线性化pBS/U6载体,采用酶切法及测序鉴定重组质粒的正确性;将重组质粒转染至人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2中,采用Western blot法和免疫荧光法观察该重组质粒对CD147内源性表达的抑制作用。结果酶切鉴定和测序证实成功构建pBS/U6/CD147-shRNA,且对人肝癌细胞SMMC-7721和HepG2 CD147表达有抑制作用,而以pBS/U6/CD147-shRNA3抑制作用最为显著。结论构建pBS/U6/CD147-shRNA成功,并筛选出基因抑制效果最佳的pBS/U6/CD147-shRNA3,为进一步实验打下了基础。