抗鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的VP2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗VP2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-VP2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗VP2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID 50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV VP2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。

一株鸡传染性贫血病毒对不同日龄SPF鸡的致病性研究

为评价鸡传染性贫血病毒AV1550株的致病性,取1日龄、7日龄和14日龄SPF鸡分别经胸部肌肉注射不同病毒含量的病毒液,同时设置正常对照,隔离饲养观察21 d。感染后14 d采血测定红细胞压积,21 d统计死亡率、体重变化以及胸腺、骨髓、法氏囊病变情况并测定1日龄SPF鸡感染后不同组织中的病毒载量。结果表明,1日龄SPF鸡感染AV1550株后,表现出精神沉郁、增重减缓、贫血等明显的临床症状,死亡率为53.9%;死亡鸡或观察期结束时存活鸡剖检,可见胸腺萎缩,骨髓变成淡黄色;不同剂量感染后14 d,均能引起红细胞压积显著下降;21 d时,胸腺病毒载量最高,可达10^(6.7) copies/mg。7日龄SPF鸡感染后,出现增重减缓,高感染剂量(100000EID_(50))出现贫血,部分鸡出现胸腺萎缩和骨髓病变,但病变率低于30%。14日龄SPF鸡感染后,不引起明显临床症状。研究证实,CAV对SPF鸡的致病性具有明显的日龄依赖性,红细胞压积降低、骨髓病变、胸腺萎缩以及胸腺病毒载量测定可作为评价CAV致病的指标。

一株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及致病性分析

为鉴定来自山东某种鸡场196日龄疑似鸡传染性贫血病毒(CAV)感染的2份种鸡肝脏样品的致病原,本实验利用马立克病肿瘤淋巴母细胞(MDCC-MSB1细胞)对2份肝脏样品进行病毒的分离培养与传代,每代均观察细胞是否出现细胞病变(CPE)。将传至5代的病毒液分别采用PCR和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,PCR结果显示,扩增到与CAV JL17株阳性对照一致的约600 bp的目的条带;IFA结果显示,感染分离病毒与JL17株阳性对照的细胞均出现绿色荧光,而阴性对照既未扩增到目的条带也无绿色荧光。上述结果表明分离到一株CAV,命名为SDNN2022。为分析SDNN2022株的分子特征,采用PCR扩增其VP1基因并测序,采用DNAStar软件对SDNN2022株VP1基因与GenBank登录的39株CAV参考株VP1基因序列进行同源性分析;采用Megalign分析SDNN2022株VP1的氨基酸序列,构建SDNN2022株VP1基因的进化树。VP1基因的同源性结果显示,SDNN2022株与CAV参考株的VP1基因序列的同源性为95.0%~99.8%,其中与CAV参考株JS2020-PFV的同源性最高;SDNN2022株VP1高变区的氨基酸位点(aa139~aa151)与大多数强毒株一致。但在aa89、aa92、aa411和aa417与大多数CAV参考株不同,均发生了氨基酸突变,分别为T^(89)K、G^(92)D、S^(411)T和V^(417)I,其中后两个位点的突变为本研究首次发现。SDNN2022株与CAV强毒参考株CUX-1的aa394均为谷氨酰胺,符合CAV强毒的分子特征,表明SDNN2022株为一株CAV强毒株。VP1基因的进化树结果显示,分离株SDNN2022与CAV参考株CUX-1、JS2020-PFV、CAV-JL190130等聚为一支,且与JS2020-PFV株的遗传距离最近,均属于A群,进一步表明SDNN2022株为一株强毒株。将该株病毒分别感染6胚龄SPF鸡胚和14日龄SPF雏鸡进行致病性试验,结果显示,SDNN2022株对鸡胚的致死率为30%(3/10),病死鸡胚体的肝脏黄化;该株病毒感染14日龄SPF雏鸡后7 d出现精神萎靡、呆滞、羽毛凌乱等临床症状,发病率为83.3%(5/6),但无死亡;感染后14 d,与空白对照组鸡相比,感染组鸡体重显著降低(P<0.05),胸腺明显萎缩,且胸腺指数极显著降低(P<0.01)。本研究分离到一株强毒力CAV,且对SPF鸡胚和雏鸡均具有较强的致病性,丰富了国内CAV的病毒资料,为深入研究CAV的致病机制提供了数据支持。

表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

鸡传染性贫血病毒抑制干扰素的研究进展

鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)为目前已知的指环病毒科(Anelloviridae)环病毒属(Gyrovirus)的唯一成员。CIAV直径为19~26.5 nm,无囊膜,由12个五边喇叭状的衣壳体组成二十面体结构的衣壳。CIAV对高温和化学试剂有较强抵抗力,100℃下处理15 min才能完全失活,对氯仿、乙醚和丙酮等试剂的处理也很不敏感~([1])。CIAV基因组是单链共价环状DNA,全长约2.3 kb,编码3个病毒蛋白;VP1为衣壳蛋白,是病毒颗粒中唯一的蛋白质~([3]);VP2具有多种功能,对病毒颗粒的形成至关重要~([4]);VP3在体内外可引起细胞凋亡~([2])。

3株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定、VP1基因遗传进化分析及致病性评价

为了解国内鸡场鸡传染性贫血(CIA)的流行状况和鸡传染性贫血病毒(CIAV)的遗传变异规律,以期对CIA的传播流行和预警防控提供技术支持。本试验对2020年在3个省份疑似发生CIA的3个规模鸡场采集10份组织脏器样品,应用鸡胚进行病毒的分离培养,并对培养物进行CIAV PCR检测,进而对CIAV阳性样本进行VP 1基因扩增和测序,应用Lasergene和MEGA 6.0软件,对获得的所有分离毒株结构蛋白VP 1基因序列与GenBank中CIAV参考毒株进行比对,构建系统发育进化树,同时对分离的CIAV毒株进行动物回归试验,评价其对鸡的致病性。结果显示,10份样品中3份为CIAV阳性,共分离到3株CIAV,分别命名为202006-NX-4-2、202006-SD-2-1和202006-JX-016。VP 1基因相似性分析显示,3株CIAV分离株核苷酸相似性介于97.7%~99.6%,且均与国内分离株具有较高同源性;氨基酸序列分析显示,3株CIAV分离株毒力相关位点均与国内强毒株GD-101株一致。遗传进化分析结果显示,3株分离株属于同一进化分支(Ⅱ分支),202006-SD-2-1株和202006-JX-016株与JL15120株进化关系最近,202006-NX-4-2株则与以国内强毒株GD-101株为代表的其他Ⅱ分支参考株进化关系最近。动物回归试验结果显示,3株CIAV均能够引起1日龄鸡发生严重的淋巴器官萎缩、骨髓黄化,为典型的高致病性病毒株特征。本试验结果为当前国内CIAV的流行、毒株的遗传变异分析及相关疫苗研发提供了参考依据。

鸡贫血病毒Taq Man探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡贫血病毒(CAV)的基因序列,选取一段高度保守的基因序列作为目的片段设计引物与探针,将该目的片段克隆到pMD18-T载体中,作为阳性标准品。通过优化荧光定量PCR反应条件,建立了CAV的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该检测方法的敏感性达到10个病毒拷贝/μL,与其他禽病病毒无交叉反应,批间与批内重复试验相关系数都小于5%。实验数据证明该检测方法敏感性高,特异性好,重复性佳。

鸡传染性贫血病毒与其他禽免疫抑制性疾病病毒的混合感染

应用多重PCR方法对广西主要养鸡地区的514只可疑鸡传染性贫血与其他禽免疫抑制性疾病临床病/死鸡进行了检测。结果显示,鸡传染性贫血病毒(CIAV)与其他禽免疫抑制性疾病病毒的二重或多重感染率达48.05%;CIAV阳性鸡群中,马立克氏病病毒(MDV)、网状内皮增生症病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)的群阳性率和个体阳性率均明显高于CIAV阴性鸡群,表明CIAV的感染与3种肿瘤病病毒的感染具有明显相关性,其中CIAV与MDV的感染具有明显相互促进作用;被调查鸡群中,传染性法氏囊病病毒(IBDV)和禽呼肠孤病毒(ARV)也有一定的感染率。结果表明,商业鸡群中各种免疫抑制性病毒的混合感染很普遍,与鸡群临床上所表现的生长阻滞、疫苗免疫效果不佳、总的发病率和死淘率增加等密切相关。

新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因对裸鼠荷HCT肿瘤的治疗

目的 :寻求有效的肿瘤基因治疗方法 ,研究新城疫病毒HN基因与鸡贫血病毒VP3基因在无胸腺裸鼠体内的抗肿瘤作用。方法 :建立BALB/c裸小鼠荷人结肠癌模型 ,瘤内注射脂质体包裹的真核重组子 pVHN和pVVP3。观测 pVHN和pVVP3治疗荷HCT裸鼠的效果 ,免疫组化法检测肿瘤细胞Bcl 2和PCNA的表达。结果 :经HN基因和VP3基因联合治疗组的小鼠与荷瘤对照组小鼠相比 ,肿瘤体积明显缩小 ,抑瘤率可达 70 %。病理组织切片表明 ,治疗组裸鼠体内肿瘤细胞大量凋亡 ,局部地方可见细胞消失。免疫组化表明 ,Bcl 2和PCNA蛋白在荷HCT裸鼠对照组与各治疗组均有表达 ,其中Bcl 2表达在荷瘤对照组与pVHN治疗组差异有显著意义 (P <0 .0 5 ) ,PCNA表达在荷瘤对照组与 pVHN +pVVP3治疗组差异极其显著 (P <0 .0 1)。结论 :NDVHN基因与凋亡素VP3基因对裸鼠荷HCT肿瘤细胞的增殖有一定抑制作用 ,可诱导其凋亡 ,其凋亡可能与下调Bcl 2表达有关。

鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其在疫苗污染检测中的应用

为了更快速而灵敏地检测禽弱毒疫苗中鸡传染性贫血病毒(CIAV)的污染,根据CIAV基因组保守序列设计合成了引物及TaqMan探针,通过优化反应条件建立了快速检测CIAV的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的检测方法灵敏度可达10拷贝·μL^(-1),比常规PCR灵敏度高100倍。该方法与禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒以及马立克病病毒等病毒基因均无交叉反应,具有很好的特异性;批内重复和批间重复显示变异系数均小于2%,呈现良好的可重复性。在模拟试验中,该方法能够检测到1 000羽份弱毒疫苗中1个EID50的低剂量污染,应用该方法从送检的39种(批)商品化禽用弱毒疫苗中检测到2份为CIAV阳性。上述结果表明,本研究建立的荧光定量PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,可用于检测疫苗中CIAV低剂量的污染。

4株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

为了解广东地区鸡传染性贫血病毒(CAV)的流行和变异情况,本研究于2014年从广东省大型鸡场采集了12份可疑样品,经PCR鉴定、全基因组测序分析和动物回归试验,共分离得到4株CAV(GD-101、GD-102、GD-103和GD-104)。动物实验结果显示:4株CAV能够引起鸡严重的骨髓黄化和胸腺萎缩,具有典型的高致病性病毒株特征。遗传进化分析结果表明,4株分离株处于同一进化分支(II分支),GD-101和GD-102株与中国GD-B-12株进化关系最近,GD-103及GD-104株与中国SC-SM株进化关系最近,表明本研究所分离到的4株CAV均为高致病性的II分支病毒株,本研究为深入研究广东地区CAV的流行情况提供了参考依据。

鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病毒基因组保守区域设计1对扩增片段为164 bp的特异性引物,应用SYBR GreenⅠ染料建立了鸡传染性贫血病毒(CIAV)荧光定量PCR检测方法。以本室构建的阳性重组质粒作为模板,制定标准曲线,对CIAV阳性样品进行了敏感性、特异性和重复性、稳定性试验,并应用于临床检测。结果表明引物最佳终浓度为0.2μmol/L,制作的标准曲线定量浓度范围宽,最低可检测到每个反应相当于10个拷贝的标准品DNA;与IBDV、ARV、MG都不反应;重复性、稳定性试验的变异系数都较小。对保存的25份疑似CIAV样品进行荧光定量PCR检测,结果检出9份阳性。本研究建立的荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上鸡感染CIAV的检测。

马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

采用PCR方法分 3段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株 (EIAVDLA)的前病毒DNA ,这 3个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组 ,PCR产物经克隆后顺次连接 ,获得 1个含有EIAV全基因 (8.0kb)的重组质粒 ,将其命名为p8.0。将此 8.0kbEIAV全基因再亚克隆到含有一完整EIAVDLA株长末端重复序列的质粒中 ,获得一含有EIAV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒 ,将其命名为p8.2 ,经核苷酸序列分析 ,证明p8.2含有EIAV前病毒的全基因。用p8.2转染驴白细胞 ,将其作为种毒进行传代 ,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶活性 ,说明在驴白细胞中由p8.2衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后 ,第 4天出现病变 ,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子 ,进一步证明p8.2具有感染性 ,笔者获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆 。

家禽活疫苗中鸡传染性贫血病毒PCR检测方法的建立

为建立不依赖于病毒分离的快速,特异的禽活疫苗中鸡传染性贫血病毒(CAV)监测方法,本研究建立了CAV的PCR检测方法。试验表明:该PCR不仅具有良好的CAV特异性,且检测灵敏度达3.98个TCID50/反应。用该方法监测9份随机抽取的商品禽用活疫苗发现,其中2份活疫苗呈PCR强阳性。以上结果表明,本研究建立的鸡传染性贫血病毒PCR检测方法具有特异、敏感等特点,能用于禽用活疫苗中CAV污染的快速监测。

鸡贫血病毒VP1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物学特性的初步分析

将鸡贫血病毒 (CAV)VP1蛋白 44 9个氨基酸中的 42 4个氨基酸 (占 95 % )编码序列分二段 ,分别克隆入表达性载体 pGEX - 5X - 3,在大肠杆菌以GST融合蛋白的形式获得了高效表达。以表达产物免疫小鼠 4次 ,制备了抗CAV的多克隆抗体。通过对CAV感染的MSB1细胞做间接免疫荧光试验 (IFA) ,结果为阳性。这表明表达物保留了天然VP1相关的抗原性。用此抗CAV抗体和所建立的IFA方法对临床CAV凝似病料成功地进行了实验室诊断。

鸡贫血病毒DNA的PCR扩增及其分子克隆

用ＰＣＲ方法扩增了国内分离的鸡贫血病毒（ＣＡＶ）ＳＪ１株的含ＶＰ２、ＶＰ３以及部分ＶＰ１的１５００ｂｐＤＮＡ片段。经限制性内切酶酶切分析，该片段与Ｃｕｘ－１株的酶谱相似。同时，以ｐＵＣ１１９质粒载体克隆了这一ＤＮＡ片段。

鸡传染性贫血病毒广西株全基因组的克隆与序列分析

为了解鸡传染性贫血病毒（CIAV）广西分离株全基因变异情况,设计3对特异性引物,对CIAV广西分离株（GXC060821）的全基因进行PCR扩增、克隆和序列分析。结果显示,广西分离株的全基因为2 292个核苷酸,含有3个互相重叠的开放阅读框（ORF）。序列分析表明,本CIAV分离株与国内外其他31个CIAV毒株比较核苷酸的同源性在96.1%~98.5%之间,推导氨基酸的同源性在89.8%~94.2%之间。全基因系统发育进化树分析显示,广西分离株和中国的TJBD40株、LF4株都处于一个分支,它们的亲缘关系较近,而与美国的98D06073分离株及中国的HA4分离株的亲缘关系较远。

鸡贫血病毒VP3基因与人IL-18基因的共表达对人肝癌细胞BEL-7402的作用

目的利用凋亡素和IL18基因的抗肿瘤优势,设计构建共表达凋亡素和hIL-18基因的真核重组子,检测其在体外对人肝癌细胞BEL7402的作用效果,旨在探索新的肿瘤基因治疗方法。方法将凋亡素VP3基因与hIL-18基因一同克隆到真核表达载体pVAX1上,构建重组质粒pVVP3IL-18,经脂质体介导,转染人肝癌细胞BEL7402,AO/EB染色,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和流式细胞仪分别分析凋亡细胞的形态学变化、DNA断裂情况和不同细胞周期的DNA含量变化,透射电镜分析凋亡细胞超微结构变化。结果随着转染时间的延长,重组质粒pVVP3IL18所表达的目的蛋白对BEL7402细胞的杀伤作用逐渐增强,作用48h,形态学观察表明BEL7402细胞发生明显的凋亡,凋亡率可达(56.5±11.9)%,并且大部分细胞为TUNEL阳性着色,流式细胞术分析可见明显的亚二倍体凋亡峰,透射电镜观察可见细胞核固缩、染色质聚集等典型的凋亡超微结构变化。结论联合应用凋亡素与hIL18基因,在体外对人肝癌细胞BEL7402具有明显的凋亡诱导作用。

鸡贫血病毒vp3基因体内抑瘤效应的实验研究

目的 观察鸡贫血病毒 ( chicken anem ia virus,CAV) vp3基因的体内抑瘤效应。方法 分别将 pc DNA- vp3(含 vp3基因的真核表达载体 )、pc DNA3 (空载体 )和小鼠腹水型肝癌细胞株 H2 2混合后 ,接种于 BAL B/ c小鼠皮下。几天后 ,处死动物 ,取肿瘤组织称重 ,比较试验组和对照组瘤重差异 ,确定 vp3基因的抑瘤效应。TU NEL 法鉴定 vp3在体内诱导肿瘤细胞死亡的方式。结果 注射 vp3基因的试验组肿瘤生长率明显低于注射空载体的对照组。TUNEL 试验的结果也表明 ,鸡贫血病毒 VP3蛋白在体内以凋亡方式诱导肿瘤细胞死亡。结论 预示

感染性马传染性贫血病毒嵌合克隆的构建

在已有的全长感染性克隆pFD3的基础上,构建了新的低拷贝的全长克隆pLGFD3-8。按照疫苗制备过程中env基因的变化情况,采用基因替换和定点突变的方法,构建了一系列具有马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株env基因及其主要突变特征的嵌合克隆。利用这些克隆转染FDD细胞,并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性。结果发现,在FDD细胞中传代3次后,可在细胞培养物中检测到逆转录酶活性和原病毒DNA的存在,在电镜下可以观察到典型的EIAV病毒颗粒。这一结果为进一步研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和免疫保护机理奠定了良好的基础。