改良差时贴壁法分离培养鉴定小鼠骨髓间充质干细胞和内皮前体细胞

目的探索同时从小鼠骨髓分离培养间充质干细胞(MSCs)与内皮前体细胞(EPCs)及对其鉴定的方法。方法小鼠骨髓细胞经改良差时贴壁法分离,以48h为时间点,48h内贴壁细胞传至3代后行成骨、成软骨、成脂分化诱导实验,流式细胞术(FCM)检测其表面标记;48h后收集未贴壁细胞,传至3代后行血管形成实验,传至5代后行CD31免疫荧光细胞染色实验,FCM检测其表面标记。结果第3代48h内贴壁细胞可诱导分化为骨、软骨和脂肪细胞,FCM检测Sca-1、CD29、CD45、CD11b阳性率分别为(98.30±0.75)%,(97.47±1.32)%,(1.87±0.15)%,(1.03±0.71)%;第3代48h后贴壁细胞在基质胶上可形成血管样结构,第5代48h后贴壁细胞特异性表面抗原CD31呈阳性表达,FCM检测CD34、CD133、血管内皮生长因子受体(VEGFR2)阳性率分别为(88.90±1.18)%,(92.73±2.90)%,(87.63±1.79)%。结论采用改良差时贴壁法可同时分离培养扩增小鼠骨髓MSCs和EPCs,且简便高效稳定可重复。

不同分离方法对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响(英文)

背景:目前并没有特定的实验对骨髓间充质干细胞分离的两种基本方法进行系统评估,所以贴壁分离法和密度梯度离心法对细胞诱导分化是否存在不同影响,尚无定论。目的:拟验证两种基本分离方法对骨髓间充质干细胞成软骨分化影响的差别。设计、时间及地点:对照观察实验,2005-03/09在中国医科大学附属盛京医院儿外实验室完成。材料:2～3月龄体质量1.2～2.0kg的日本大耳兔20只用于抽取骨髓。方法:用贴壁分离法和密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。选择两组同代的骨髓间充质干细胞,用转化生长因子β1诱导其向软骨方向分化。主要观察指标:①倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞的生长情况,绘制两组细胞生长曲线。②免疫组化检测两组Ⅱ型胶原表达。③原位杂交检测两组细胞Ⅱ型胶原mRNA表达。结果:绘制生长曲线表明两组细胞生长速度趋于一致。免疫组化法检测两种方法分离的骨髓骨髓间充质干细胞的软骨细胞分化率为76.1%和77.7%,原位杂交法检测的软骨细胞分化率为70.3%和71.0%,差异无显著性意义。结论:两种分离方法对骨髓间充质干细胞的生长和成软骨分化结果的影响无差异。

MSCs 2种分离培养方法及其培养液中的VEGF、SDF-1α浓度比较

目的通过2种分离培养方法所得骨髓间充质干细胞(MSCs)的生长特征和微环境中细胞因子的比较,提供一种可以快速、安全、高效地为临床和实验提供大量优质MSCs的方法。方法提取C57BL/c小鼠的骨髓,分别作密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养分离法分离培养MSCs,通过流式细胞仪检测细胞表面CD29+、CD31-、CD34-、CD45-表达水平,并比较各自所得细胞的生长曲线;ELISA检测培养液中的血管内皮生长因子(VEGF)、SDF-1α浓度并比较二者的差异。结果与密度梯度离心法比较,全骨髓贴壁分离法所得原代细胞有较快的生长速度,较短的生长周期;培养液中VEGF和SDF-1α浓度也稍高于密度梯度离心法。结论全骨髓贴壁培养法可以快速、方便、有效地为临床和实验提供大量MSCs,所得细胞的培养环境优于密度梯度离心法,减少了对细胞功能的损害。

小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离扩增及鉴定

目的:探讨一种简单易行的的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)体外分离培养方法。方法:通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增小鼠BMSCs。观察原代及传代小鼠BMSCs形态变化,对第3代小鼠BMSCs表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106进行流式细胞仪检测。结果:小鼠BMSCs的原代接种培养24h后可见大量悬浮细胞,少许贴壁细胞,呈小圆形;72h后贴壁细胞逐渐增多,培养至第7天细胞伸展成长梭形,呈集落生长。BMSCs在培养的2～6d细胞增殖较慢,7～10d细胞增殖较快。传代后的小鼠BMSCs 24h基本全部贴壁,呈均匀性梭行细胞样生长。流式细胞仪检测结果显示:CD105、CD106表达阳性,表达率分别为92.2%、90.4%;CD34、CD45表达阴性,表达率分别为8.8%、13.1%。结论:采用全骨髓贴壁分离法操作简便,是培养小鼠BMSCs的理想方案。流式细胞术可以鉴定体外分离培养的小鼠BMSCs。

骨髓贴壁细胞向破骨细胞的分化

背景:一般认为采用贴壁分离法得到的小鼠骨髓中能够贴壁的细胞为间充质干细胞,并能分化成为成骨、成脂肪及成软骨细胞,其中贴壁的细胞是否有分化为破骨细胞的潜能尚不明确。目的:检测贴壁分离法得到的小鼠骨髓中能贴壁的细胞是否能够分化为破骨细胞。方法:采用贴壁法得到小鼠原代间充质干细胞,以及通过贴壁1-5 d后得到不同时间贴壁的骨髓细胞。原代间充质干细胞及不同时间贴壁的骨髓细胞分别用普通培养基,及含m-csf和RANKL培养基,培养9 d后进行碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶染色。原代间充质干细胞传代后,第2代间充质干细胞分为4组,分别用普通培养基、含m-csf培养基、含RANKL培养基及含m-csf和RANKL的培养基培养,9 d后进行碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶染色。结果与结论:贴壁法得到较均一的间充质干细胞,原代及传代贴壁细胞的联合诱导组抗酒石酸酸性磷酸酶染色均为阳性,说明原代和传代的贴壁骨髓细胞中均有可以分化为破骨细胞的细胞。不同时间贴壁的细胞诱导后碱性磷酸酶及抗酒石酸酸性磷酸酶染色有差异,说明不同时间贴壁的细胞存在分化差异。

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景:流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的:采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法:采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论:经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。

制备嵌合体小鼠实验中ES细胞的处理方法

目的介绍两种制备嵌合体小鼠实验中ES细胞的处理方法。方法一种为差速贴壁分离法即消化后的ES细胞接种在明胶包被的平皿中,利用饲养层细胞与ES细胞贴壁速度的不同来分离ES细胞;另一种方法为冰水浴自然沉淀分离法,即消化后的ES细胞移入15ml离心管中冰水浴,利用细胞间自然沉淀的位置不同分离ES细胞。结果两种方法均可得到足够数量处于未分化状态的ES细胞。结论这两种方法都可以应用于制备嵌合体小鼠实验中的ES细胞处理。