贴壁培养细胞台盼蓝拒染试验的方法学探讨

本工作旨在探讨贴壁培养细胞台盼蓝拒染试验的方法,为其合理应用提出建议。用正常培养及NaN_3作致死处理的人视网膜色素上皮细胞株-19,进行原位贴壁细胞和培养体系上悬液中细胞的台盼蓝拒染实验,并比较其原位法与计数板法所测活细胞率。与计数板法相似,随染液浓度增高或染色时间延长,原位台盼蓝拒染实验的活细胞率检测值逐渐增加。培养体系上悬液中脱落细胞的存活率显著低于贴壁的细胞,NaN_3处理使脱落细胞增加。因此,对于贴壁牢固的培养细胞,原位台盼蓝染色是检测活细胞率的实用方法。根据细胞从培养表面上消化下来的难易程度和脱落到培养上悬液中的数目多少,可选用原位染色法或/和计数板法台盼蓝拒染试验,从而检测贴壁培养细胞的总存活率。

适于无血清贴壁培养的抗凋亡宿主细胞系CHO-IVB2的构建

应用无血清培养基培养CHO细胞时 ,由于没有血清提供各种贴壁因子 ,细胞以悬浮的方式生长。在实际的大规模细胞培养中 ,CHO细胞往往以贴壁方式培养 ,要么贴壁于悬浮的微载体中 ,要么贴壁于固定的聚酯盘状介质或中空纤维中 ,而很少直接悬浮于培养基中。在无血清培养基中 ,Vitronectin单一组分可以促使CHO细胞的贴壁和扩增。通过双表达Igf_1和Bcl_2基因 ,已经构建了可以在无蛋白培养基IMEM中抗凋亡生长的细胞株CHO_IB3。在此基础上 ,构建了可以同时表达Igf_1、Vitronectin和Bcl_2三个蛋白的三顺反子表达载体pCI_NII_IVB。将该载体转染于CHO_dhfr- 细胞中 ,构建了一个细胞株CHO_IVB2。该细胞株可以在无蛋白培养基中抗凋亡生长 ,适于以贴壁的方式大规模培养 。

贴壁培养方式中昆虫细胞的生长限制性因素研究

以昆虫细胞为宿主生产病毒杀虫剂或进行基因工程产品的开发，是动物细胞培养领域十分有吸引力的研究方向。近年来，昆虫细胞的体外培养尽管在培养条件的优化［１］、培养基的开发［２］以及工艺流程的设计［３］等诸多方面取得了令人鼓舞的进展，但由于对影响细胞生长及代...

猪尾小组织块贴壁培养法分离培养成纤维细胞及转染效率的研究

目的采取猪尾小组织块贴壁法成功分离培养出原代猪成纤维细胞并进行细胞不同时期的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性质粒转染效率的研究。方法猪尾小组织块贴壁培养法分离培养出原代猪成纤维细胞后,传代并进行冻存和复苏,比较猪成纤维细胞原代培养、传代培养和复苏细胞存活率。绘制细胞原代培养、传代培养和复苏后的生长情况。分别在猪尾小组织块贴壁培养获得原代成纤维细胞,细胞传代和复苏后进行细胞GFP阳性质粒的Neon电转染,比较不同转染时期细胞存活率和生长情况,转染后24h和48h分别采用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的GFP质粒阳性表达率。结果猪尾小组织块贴壁培养可以成功分离培养出猪成纤维细胞,细胞冻存后复苏能保持原代细胞生物学特性,原代细胞活力很高,细胞存活率97.670%,传代培养后细胞存活率95.670%,复苏细胞存活率仍在90%以上。原代培养、传代培养和复苏培养细胞生长曲线均呈"S"型,复苏细胞生长略微缓慢。原代培养、传代培养和复苏细胞电转染后细胞存活率均有少许下降,细胞生长增殖能力减弱,但是细胞生长曲线仍呈"S"型曲线。Neon电转染后24h均可获得GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,荧光显微镜均检测到GFP质粒阳性表达的成纤维细胞,48h后流式细胞仪检测显示原代细胞阳性率8.01%,稍高于传代细胞的7.91%和复苏细胞的7.86%。复苏细胞存活率下降,转染后细胞活力下降,但转染后仍可得到7.86%GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,原代培养细胞能够获得更高的阳性率,差异有统计学意义。结论猪尾小组织块贴壁培养法可以成功分离培养出成纤维细胞,细胞传代会对细胞活力有影响,冻存后复苏也会影响细胞的存活率和细胞增殖能力。原代细胞、传代细胞和复苏细胞转染均能获得GFP阳性质粒表达。原代培养细胞具有更佳的细胞活力和阳性转染率,进行基因敲除或基因敲入等基因编辑和体细胞克隆研究,选择原代细胞作为转染对象能获得更好的基因编辑成功率。

栅藻贴壁培养处理沼液效果的研究

以栅藻(Scendesmus dimorphus)为研究对象,将微藻培养和养猪沼液废水处理相结合,通过贴壁培养在处理沼液废水的同时耦合藻类油脂生产,并比较了栅藻贴壁培养与悬浮培养藻细胞生长情况及对N的利用效率,为藻类生物燃料生产及降低沼液废水处理成本提供理论依据。结果表明:贴壁培养下藻细胞生物产率为6.15 g·m-2·d-1,高于栅藻悬浮培养的生物产率5.48 g·m^(-2)·d^(-1);贴壁培养下藻细胞对N的吸收率为85.23%,高于悬浮培养N的利用率77.84%。在初始NH_3-N、TP及COD浓度分别为281.2、29.1、551 mg·L^(-1)的沼液废水中贴壁培养栅藻,藻类生长状况与正常BG11培养相近,生物产率分别为6.26 g·m^(-2)·d^(-1)与6.23 g·m^(-2)·d^(-1);油脂含量相差不大,分别占细胞干重的34.6%、35.2%;沼液废水中NH_3-N、TP及COD去除效率分别为99.04%、73.06%和72.32%。

微藻贴壁培养对沼液废水的处理效果

以产油藻类栅藻、小球藻为研究对象,通过贴壁方式考查微藻处理养猪沼液废水的效果。结果表明,栅藻、小球藻均能在沼液中较好生长,其生物产率分别是6.26、6.08 g·m^(-2)·d^(-1),与在正常培养基上(BG11)相当。栅藻、小球藻在沼液中培养,藻细胞油脂积累分别占细胞干重的34.6%和31.4%,与正常培养基相差不大。栅藻、小球藻均能较好净化废水中主要污染指标氨氮(NH_3-N)、总磷(TP)及化学需氧量(COD),栅藻的去除率分别是96.59%、74.52%和72.47%,小球藻去除率分别是94.90%、73.55%和71.40%。本研究将产油微藻培养和养猪沼液废水处理相结合,研究结果可为藻类生物燃料生产及沼液废水资源化利用等提供理论基础。

普通冰箱短期冻存贴壁培养细胞

依据贴壁培养细胞的生长特点,仅用普通冰箱进行细胞冻存,短期保存了细胞株L929细胞达2个月,在一定程度上丰富了细胞培养技术,对细胞培养工作起到了减负作用。

栅藻贴壁培养供氮策略研究

[目的]贴壁培养是微藻培养的一种新方法,具有克服传统液体悬浮培养方式耗水量大、收获困难、能耗高等优势。当该方法用于培养富油微藻时,一个亟待回答的问题是如何调控氮元素供给以获得高产油率。本文旨在研究氮元素对微藻贴壁培养时生长和油脂积累的影响以及优化氮营养的供给。[方法]以栅藻(Scenedesmus obliquus)为目标藻种进行贴壁培养,设定不同氮浓度和总氮量处理,检测不同氮供给方式对栅藻生长和油脂积累的影响。[结果]在贴壁培养条件下,恒定氮浓度为1.76mmol·L^(-1)时,栅藻总脂和TAG产率分别高达3.80和2.01g·m^(-2)·d^(-1)。总氮量为1.76mmol时,可使得160cm^2的栅藻总脂和TAG产率达到最大值。[结论]栅藻贴壁培养优化供氮策略为60L氮浓度为1.76mmol·L^(-1)的BG-11培养基可使得1m^2接种量为10g·m^(-2)的栅藻的总脂和TAG产率达到最佳值。

贴壁培养细胞染色体原位制备方法

贴壁培养细胞染色体原位制备方法张进华，丁彦青，张亚历（广州第一军医大学病理学教研室，广州５１０５１５）染色体是细胞在准备分裂前，核中出现的独立深染小体，是细胞遗传的物质基础，是遗传信息的贮存库。染色体的数目和结构的畸变（或突变）与某些疾病的发生发展，...

贴壁培养细胞免疫电镜标本制备的原位包埋法

贴壁培养细胞免疫电镜标本制备的原位包埋法赵燕妮，王明武（中国医科大学电镜中心实验室，沈阳１１０００１）本文介绍了一种简便、适于制备贴壁培养细胞免疫电镜标本的原位包埋法。该法以原位包埋为基础，避免了通常方法在免疫染色前对细胞膜的机械损伤，从而保证了细胞...

非冻存低温下维持贴壁培养细胞

目的建立非冻存低温条件下维持贴壁培养细胞的方法。方法常规培养贴壁生长的小鼠成纤维细胞L929,然后接种12瓶细胞,第二天封口后分别放置室温和4℃冰箱,间隔3d各取1瓶细胞观察细胞存活比率,连续5次,最后两瓶继续培养。结果细胞存活率随时间延长降低,15d后存活率分别为90%和85%,并且存活传代。结论非冻存低温条件下可以短期维持贴壁培养细胞,该方法丰富了细胞培养技术。

贴壁培养法鉴定海马神经干/祖细胞的增殖与分化能力

背景:神经干/祖细胞广泛应用于神经发育、神经相关性疾病和细胞移植等研究,体外分离培养的神经干/祖细胞能够为相关研究提供细胞模型。目的:探讨分离新生小鼠海马组织并高效培养出神经干/祖细胞的方法,并使用贴壁培养法对其增殖以及分化能力进行鉴定。方法:分离新生C57BL/6小鼠海马组织,培养原代神经干/祖细胞并扩增,进行形态学观察;联合使用多聚赖氨酸和层粘连蛋白促进细胞贴附,进行贴壁培养;免疫荧光法检测特异性标志蛋白Nestin表达和增殖指标Ki-67的表达;使用神经干/祖细胞分化培养基诱导分化培养7 d后,免疫荧光法检测GFAP、DCX、Tuj1和S100β的表达。结果与结论:(1)培养的神经干/祖细胞约82%表达Nestin,约49%表达Ki-67;(2)诱导分化后,少数细胞为DCX阳性,大多数细胞为GFAP阳性。荧光双色染色后显示Tuj1和S100β表达的神经元和星形胶质细胞比例为1∶1.7;(3)结果显示,从新生C57BL/6小鼠海马组织中成功分离并高效培养出神经干/祖细胞,贴壁培养后有效地对其增殖和分化能力进行了鉴定,能够为进一步实验研究提供足够的细胞来源。

全骨髓贴壁培养兔骨髓间充质干细胞的初步研究

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复骨缺损的可能性。方法:选取2月龄约2.5 kg重健康新西兰兔8只,采用全骨髓贴壁培养法体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,通过倒置相差显微镜观察、MTT检测、细胞贴壁率检测观察细胞生物学特性。结果:全骨髓贴壁培养法培养出的原代骨髓间充质干细胞活力良好,细胞数量经传代后扩增,且细胞纯度提高,但细胞扩增速度较慢。结论:全骨髓贴壁培养法简便易行,能有效的在体外获得原代骨髓间充质干细胞。所提取的细胞活性良好、纯度较高,能用作组织工程种子细胞治疗骨缺损。

贴壁培养布朗葡萄藻净化工业废水的小试研究

随着传统化石燃料短缺和环境污染日趋严重,微藻因其繁殖快、含油量高、固碳效率高及易于与现代工业技术集成等优势成为近年来生物能源研究的热点。与其它微藻相比,布朗葡萄藻更多的是合成与传统化石原料更相近的烃类。因此,通过生物炼制制备的生物燃料与传统汽柴油更接近,更易于实现燃料替代。文章以布朗葡萄藻Botryococcus braunii SAG 807-1为主要研究对象,尝试了含钴废水进行葡萄藻贴壁培养的可行性。结果表明,含钴废水可用于葡萄藻Bbraunii SAG 807-1贴壁培养,并可以促进烃类的合成。

悬浮培养与贴壁培养方式神经干细胞分化表型特点

目的观察神经干细胞在悬浮培养与贴壁培养方式下的形态学特点及分化表型。方法新生6 h内的大鼠皮质应用无血清悬浮培养与贴壁培养神经干细胞(NSCs)技术培养,观察神经干细胞的形态学特点。体外胎牛血清(FBS)诱导NSCs分化,通过巢蛋白(Nestin)和GFAP免疫荧光染色鉴定分化表型。台盼蓝活细胞计数法比较细胞增殖能力。结果新生大鼠皮质应用无血清悬浮培养可获得稳定的NSCs细胞球,应用贴壁培养形成长梭状NSCs,NSCs巢蛋白免疫荧光染色结果呈阳性。体外FBS诱导分化后,神经球内开始出现放射状的神经纤维丝,免疫荧光染色可见GFAP阳性细胞向外伸展以及Nestin阳性细胞边集。贴壁的NSCs分化成星形胶质细胞,免疫荧光染色可见Nestin和GFAP染色阳性细胞。在相同条件下,应用悬浮培养在第2~3 d时增殖速度最大,而以贴壁培养方式培养出的神经干细胞在第4~5 d时增殖速度最大。结论应用无血清培养物B27与b FGF、EGF组合的NSCs完全培养基通过悬浮培养法与贴壁培养法,都可以成功在体外培养出NSCs;悬浮培养法培养NSCs在早期增殖速率上优于贴壁培养法。

小鼠胚胎神经干细胞的分离及贴壁培养方法

目的探索一种改进的贴壁培养神经干细胞的方法。方法从胚胎期为15.5d的胎鼠大脑皮层中提取神经干细胞,在PO/FN(Poly-L-ornithine hydrochloride/Fibronectin)包被处理后的培养瓶中进行贴壁培养并传代,在倒置显微镜下观察神经干细胞的细胞形态,并通过免疫荧光法鉴定神经干细胞及其子代细胞进行分化操作之后的情况。结果原代神经干细胞细胞形态清晰,免疫荧光标记物明显。结论相对于传统神经球悬浮培养法该法处理简便,传代损耗低,容易观察到细胞形态和分化阶段,更有助于神经干细胞的培养和存储。

微藻生物膜贴壁培养及其在废水处理中的应用

基于一类新型微藻生物膜贴壁技术的特征及运行原理,分析了不同类型生物膜贴壁装置的特点及相关影响因素,阐释了生物膜材料对贴壁微藻生长的影响。讨论了微藻生物膜的形成机制,发现生物膜形成过程中起关键作用的主要是藻细胞胞外聚合物(EPS)的作用。概述了生物膜贴壁微藻在农业废水、工业废水及生活污水处理中的应用。研究优化生物膜贴壁培养装置及相关工艺条件,在净化污染水体的同时还可生产藻类高价值产品。耦合废水处理集成的微藻生物膜贴壁培养体系将具有藻类生产经济性和环保应用潜力。

葡萄藻生物膜贴壁培养处理含钴工业废水与烃类生产的耦合

工业废水污染日趋严重,水体中重金属钴污染因难处理、高危害等问题成为废水净化的关键.传统治理重金属工业废水的方法难以应用.为寻求处理工业废水"绿色生态"可行性路径,本文以葡萄藻Botryococcus braunii SAG 807-1为研究对象,应用贴壁培养技术对含钴工业废水进行处理研究.结果表明,葡萄藻贴壁培养可处理工业废水,4.5 mg·L^(-1)Co^(2+)对葡萄藻生长影响不大,却可以促进长链烃类的合成,提高烃产量.葡萄藻贴壁培养去除Co2+的能力为1 473.9μmol·g^(-1),远高于报道的微藻P.littoralis.本研究为绿色高能燃料烃类的生产与工业废水处理耦合提供理论基础.

胶质母细胞瘤中CD133^+细胞的贴壁培养和乙醛脱氢酶1的表达

目的探讨贴壁培养对获取胶质母细胞瘤中CD133+细胞的影响,观察细胞分化前后乙醛脱氢酶1(ALDH1)的表达情况。方法采用贴壁培养法将7例胶质母细胞瘤组织行原代培养,使用免疫磁珠法分选出CD133+细胞。将部分细胞在血清条件下培养以诱导其分化,通过荧光免疫细胞化学染色观察细胞分化前后ALDH1与胚胎干细胞关键蛋白(Sox2)的表达。结果 7例标本中,6例获得了CD133+细胞,并观察到典型的肿瘤球形成。诱导分化前肿瘤球ALDH1与Sox2表达阳性,二者有共定位现象。诱导分化后上述抗体表达阴性。结论贴壁培养法可有效获取CD133+细胞。ALDH1仅在分化前的细胞中表达,有可能成为今后研究胶质瘤干细胞的新标志物。

生物膜贴壁培养小球藻净化猪粪沼液废水的效果

微藻处理猪粪沼液废水是一项污水资源化生物技术.本文以小球藻为研究对象,通过贴壁培养方式,对稀释不同倍数的猪粪沼液废水进行净化处理同时提取藻细胞油脂,旨在探究小球藻贴壁培养处理猪粪沼液废水的效果,分析小球藻耐受猪粪沼液废水的氨氮浓度.将猪粪沼液废水分别稀释1倍(原水)、2倍、5倍、10倍制成培养基.测定贴壁培养小球藻对各处理组猪粪沼液废水中COD、氨氮、总氮、总磷的去除效率及对重金属铜、锌、铁的富集效果,同时探究小球藻的油脂合成情况.结果表明,当猪粪沼液废水稀释5倍时,贴壁小球藻对COD、氨氮、总氮、总磷的净化效果最佳,其去除效率分别为:86.8%、94.1%、85.2%、84.3%;油脂含量高达32.7%;对重金属铜、锌、铁的去除效率分别为:72.9%、70.0%、73.0%;培养一个周期结束时生物产率达到4.21 g·(m^2·d)^(-1).该研究将微藻与难处理的猪粪沼液废水深度净化进行了有效的结合,为实现藻类生物燃料工艺生产及降低废水处理成本提供理论基础.