贴壁培养法鉴定海马神经干/祖细胞的增殖与分化能力

背景:神经干/祖细胞广泛应用于神经发育、神经相关性疾病和细胞移植等研究,体外分离培养的神经干/祖细胞能够为相关研究提供细胞模型。目的:探讨分离新生小鼠海马组织并高效培养出神经干/祖细胞的方法,并使用贴壁培养法对其增殖以及分化能力进行鉴定。方法:分离新生C57BL/6小鼠海马组织,培养原代神经干/祖细胞并扩增,进行形态学观察;联合使用多聚赖氨酸和层粘连蛋白促进细胞贴附,进行贴壁培养;免疫荧光法检测特异性标志蛋白Nestin表达和增殖指标Ki-67的表达;使用神经干/祖细胞分化培养基诱导分化培养7 d后,免疫荧光法检测GFAP、DCX、Tuj1和S100β的表达。结果与结论:(1)培养的神经干/祖细胞约82%表达Nestin,约49%表达Ki-67;(2)诱导分化后,少数细胞为DCX阳性,大多数细胞为GFAP阳性。荧光双色染色后显示Tuj1和S100β表达的神经元和星形胶质细胞比例为1∶1.7;(3)结果显示,从新生C57BL/6小鼠海马组织中成功分离并高效培养出神经干/祖细胞,贴壁培养后有效地对其增殖和分化能力进行了鉴定,能够为进一步实验研究提供足够的细胞来源。

原代大鼠主动脉血管干细胞的体外培养扩增及鉴定

目的采用“切段外膜贴壁培养法”体外培养扩增出原代大鼠主动脉血管干细胞,为开展血管重构及相关疾病研究提供实用的工具细胞。方法无菌分离2~3周龄Sprague-Dawley大鼠胸腹主动脉,切成长约2.0 mm的血管节段,均匀种瓶,经外膜贴壁固化后进行原代培养,待细胞生长融合度达80%~90%时传代。镜下观察细胞形态及其生长特性,采用流式细胞仪分析目的细胞表面标志物CD分子表达情况,成脂、成骨诱导分化实验检测其多向分化潜能。结果接种3 d后,少量梭形、星形或多角形的细胞从血管节段周围爬出;5~6 d后形成岛屿状细胞集落,细胞增殖迅速,呈放射状向外扩大,并出现细胞克隆现象;7~8 d后细胞融合成片,呈涡旋状分布;传至第3代后,细胞匀质性较高,表现为典型的“成纤维样”排列生长。流式细胞仪分析细胞主要表达CD44、CD73、CD90,阳性率分别为80.3%、62.2%、46.8%;低表达CD34、CD45、CD11b/c,阳性率分别为1.1%、0.2%、0.2%。体外诱导分化实验表明目的细胞具有成脂、成骨分化潜能。结论“切段外膜贴壁培养法”可成功分离培养出具有间充质干细胞特性的大鼠主动脉血管干细胞。

全骨髓贴壁培养兔骨髓间充质干细胞的初步研究

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞修复骨缺损的可能性。方法:选取2月龄约2.5 kg重健康新西兰兔8只,采用全骨髓贴壁培养法体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,通过倒置相差显微镜观察、MTT检测、细胞贴壁率检测观察细胞生物学特性。结果:全骨髓贴壁培养法培养出的原代骨髓间充质干细胞活力良好,细胞数量经传代后扩增,且细胞纯度提高,但细胞扩增速度较慢。结论:全骨髓贴壁培养法简便易行,能有效的在体外获得原代骨髓间充质干细胞。所提取的细胞活性良好、纯度较高,能用作组织工程种子细胞治疗骨缺损。

组织块贴壁法提取胎盘、脐带和胎膜间充质干细胞效果观察

目的为临床移植组织工程等提供足够数量的种子细胞。方法利用组织块种植贴壁培养法提取胎盘、脐带和胎膜原代间充质干细胞,观察细胞形态、最早爬出时间,计算提取成功率及鹅卵石样细胞集落比例;MTT法检测传代前和传代后细胞生长曲线。结果原代培养细胞形态呈长梭形和卵圆形,传代后为均一长梭形;胎膜来源细胞最早爬出,胎盘次之,脐带最晚,且脐带来源原代提取成功率较低、鹅卵石样细胞集落比例大。生长曲线表明传代初细胞处于缓慢增殖期,胎膜来源细胞生长较为迅速,P5代时三种来源细胞进入对数增长期,增殖均旺盛。结论组织块种植贴壁培养法可成功提取间充质干细胞;提取的干细胞传代培养后细胞形态单一,增殖旺盛,可为临床移植组织工程等提供足够数量的种子细胞。

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养与慢病毒转染方法的建立

本研究建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗提供合格的细胞。无菌条件下取大鼠股骨、胫骨,用冲洗法冲出骨髓,贴壁培养法分离纯化BMMSC,体外扩增;流式细胞术进行免疫表型鉴定,并进行成骨,成脂分化鉴定;利用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒液转染大鼠BMMSC。结果表明,贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMMSC,细胞呈均一的成纤维细胞样;流式细胞术显示,第4代BMMSC中CD29、CD44表达阳性,CD34、CD45表达阴性。在相应的诱导培养条件下,BMMSC均能成骨及成脂分化。BMMSC用慢病毒液转染后表达GFP。结论:贴壁培养法简单、可行和稳定;分离培养的细胞具有BMMSC的生物学特性和多向分化潜能;BMMSC经慢病毒液转染后表达GFP,标记效率高,可作为标记细胞的一种有效手段,适合体内示踪。

大鼠骨髓基质干细胞的改良培养方法及Hoechst体外标记研究

目的:改良大鼠骨髓基质干细胞全骨髓贴壁培养法,并进行Hoechst体外标记初步研究。方法:采用改良全骨髓贴壁法分离扩增大鼠骨髓基质干细胞,以MTT比色实验观察细胞生长状态并绘制生长曲线,行体外诱导向成骨细胞及脂肪细胞分化,以流式细胞术检测细胞表面抗原。以Hoechst体外标记大鼠骨髓基质干细胞,荧光显微镜下计数并观察Hoechest对细胞生长状态的影响。结果:改良全骨髓贴壁培养法能够在较短时间内获得纯化并具备高活性的骨髓基质干细胞,并成功诱导其分化为成骨细胞及脂肪细胞。流式细胞术检测显示细胞表面CD29、CD90、CD44均为阳性,CD45、CD34均为阴性。荧光显微镜观察Hoechst能够在体外成功标记骨髓基质干细胞,并对细胞的生长无明显影响。结论:经改良后的全骨髓贴壁培养法是获得纯化骨髓基质干细胞的一种更为简捷、高效、经济的途径,Hoechst可作为体外标记大鼠骨髓基质干细胞的标记物。

原代SD大鼠主动脉内皮细胞培养方法的建立及其鉴定

目的:建立一种简便高效的原代SD大鼠主动脉内皮细胞(AECs)培养方法,为探索AECs的分子生物学特性及开展心脑血管疾病研究提供重要的载体和工具细胞。方法:取SD大鼠1只,无菌打开胸腹腔,分离出主动脉,剔除血管外结缔组织和脂肪,将主动脉内膜外翻,切成长为1.0~1.5 mm的血管段后接种于培养瓶中,7 d后去除血管段继续培养。通过细胞形态表现观察和第Ⅷ因子(FⅧ)相关抗原免疫细胞化学染色鉴定目的细胞。结果:接种3 d后,有少量细胞从血管段周围迁移出,形成岛屿状细胞团;10~12 d后,细胞集落逐渐融合成片,铺满瓶底,呈典型的“铺路石样”镶嵌式排列。FⅧ相关抗原免疫细胞化学染色检测,细胞的胞核和胞质淡染成棕红色,表达为阳性,阳性细胞率达98%以上。结论:主动脉内膜外翻切段贴壁培养法能够成功分离培养出原代大鼠AECs。

大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定以及向神经干细胞分化的实验研究

目的:体外培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),研究其生物学特性,初步探索酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)诱导其向神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化的可行性。方法:全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察其形态特征,MTT法绘制生长曲线,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定细胞周期并鉴定细胞表面标志物。用80 ng/ml aFGF的无血清DMEM/F12培养液诱导大鼠BMSCs向NSCs分化,镜下观察细胞形态特征,免疫荧光染色方法检测神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)的表达。结果:大鼠BMSCs贴壁生长,呈梭形,多角形。第1、3、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。细胞周期显示94.34%BMSCs处于G0/G1期,有较强的分裂增殖能力。FCM检测CD29、CD54、CD90表达阳性,CD45表达阴性。诱导6 h后细胞的胞体收缩成椭圆形或球形并伸出细长突起,免疫荧光染色显示Nestin表达阳性,继续诱导发现双极和多极细胞增多,诱导6 d后相互连接成网状,成典型的神经元样细胞,NSE表达阳性。结论:全骨髓贴壁培养法能培养出高纯度的BMSCs,细胞生长稳定、增殖快、可多次传代,具有干细胞特性。经aFGF诱导后具有向NSCs分化的潜能,NSCs能进一步分化为神经元样细胞。

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养

[目的]通过实验探索并验证行之有效的体外骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养的方法。[方法]采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养。[结果]原代细胞10d左右达85%以上融合,传代后细胞约1周左右达85%以上融合;传至5代细胞形态呈较一致的长梭形。[结论]运用贴壁培养法和密度梯度离心法相结合的方法对骨髓间充质干细胞进行体外培养,可获得足够数量纯度较高的骨髓间充质干细胞。

鸽胚胎嗉囊成纤维细胞的分离培养及鉴定

为探究鸽嗉囊成纤维细胞的体外分离及培养方法,研究选择17日胚龄的鸽嗉囊组织,采用胰酶消化法和组织块贴壁培养法进行原代细胞分离,通过差速贴壁法纯化成纤维细胞。通过细胞形态观察、生长曲线测定和免疫荧光反应对细胞类型进行鉴定。结果表明,采用胰酶消化法分离培养30 h后细胞开始生长,采用组织块贴壁培养法的细胞培养72 h后开始从组织块边缘贴壁延伸生长;通过显微镜观察贴壁细胞呈梭型,连接紧密。对组织贴壁培养法获得的细胞传代后状态良好呈纺锤形,细胞培养48~84 h后快速生长,84 h后生长变缓;免疫荧光染色结果显示,波性蛋白染色为阳性,细胞核经DAPI染色呈现椭圆形,鉴定为成纤维细胞。成纤维细胞微丝在细胞周边及内部均丰富分布。研究表明,利用组织块贴壁培养法及胰酶消化法均能成功分离成纤维细胞,为后期深入研究嗉囊成纤维细胞功能奠定基础。

2种不同诱导方法体外诱导人多潜能干细胞分化成大脑基底内侧神经节隆起区神经前体细胞的差异

目的:比较单层贴壁培养法和拟胚体(EB)悬浮培养法诱导人多潜能干细胞分化为大脑基底内侧神经节隆起区(MGE)神经前体细胞分化的效率,并探讨不同浓度的SHH通路激动剂SAG对分化为MGE神经前体细胞纯度的影响,为细胞移植治疗探索优化的分化方案。方法:分别采用单层贴壁诱导法和EB悬浮法诱导人多潜能干细胞分化为神经上皮细胞,通过加入不同浓度的SAG使其腹侧化,最终诱导成表达NKX2.1的MGE前体细胞并进行计数。比较2种不同的分化方案和不同浓度的SAG对MGE神经前体细胞纯度的影响。结果:在单层贴壁诱导法中,当SAG浓度为0μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM和3μM时,NKX2.1阳性细胞率分别为0%、(48.3±11.5)%、(78.6±2.7)%、(77.6±4.0)%、(69.0±7.5)%和(67.7±7.9)%;SAG浓度为0.5μM和1μM时诱导分化获得的MGE神经前体细胞纯度显著高于其他浓度组(P<0.001或0.05)。当SAG浓度为0.5μM时,在EB悬浮培养法中NKX2.1的阳性细胞率为(74.8±6.5)%,与单层贴壁诱导法差异无统计学意义(P>0.05)。采用单层贴壁诱导法时,神经球和神经元出现的时间点均要早于采用EB悬浮培养法。结论:采用单层贴壁诱导法,0.5μM的SAG可能是人多潜能干细胞分化培养为MGE神经前体细胞的更优化方案。

密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞的形态学观察

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养、鉴定和扩增的方法,同时观察BMSCs的生长特性,为组织工程中种子细胞的选择提供实验基础。方法应用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合分离纯化BMSCs并进行体外扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况,计数细胞数目,绘制细胞生长曲线。HE染色光镜观察细胞形态,免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原CD29、CD34和CD44的表达,进行表型鉴定。结果成功地完成了兔BMSCs体外分离培养及扩增。生长特性观察发现,第1～3代细胞增殖能力强,生长旺盛,随着传代次数的增加传代细胞增殖能力逐渐下降。分离培养的BMSCs阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD34。结论体外应用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合,可获得高纯度的BMSCs,培养的BMSCs呈纤维状、克隆样生长,第1～3代细胞活性较强,可作为组织工程的种子细胞用于进一步的实验研究。

高糖下视网膜Müller细胞生长活性的变化

目的测量Müller细胞不同程度的高糖培养条件下生长活性的变化,推测Müller细胞在糖尿病性视网膜病变进展中的活性变化。方法通过组织块贴壁培养法进行视网膜Müller细胞体外培养,MTT法测定其在不同程度的高糖及作用时间下的活性OD值。结果高糖组Müller细胞培养时间为1d时表现生长增强;培养时间延长到3d以上,高糖组内见Müller细胞折光增加,随培养时间及浓度不同程度加强,其OD值逐渐呈下降趋势。结论视网膜Müller细胞在高糖作用下其生长受到显著的抑制。

骨髓间充质干细胞传代扩增培养与干细胞干性的维持关系的研究

目的建立一种体外分离、培养骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的方法，研究BMMSCs传代扩增培养与干细胞干性的维持关系。方法采用全骨髓细胞贴壁培养法对大鼠BMMSCs进行分离、培养、传代。采用倒置显微镜观察各代细胞的形态，通过流式细胞术（FACS）观察各代BMMSCs干细胞干性，通过免疫荧光检测各代BMMSCS在肝硬化模型的表达。结果大鼠BMMSCs呈均一的成纤维细胞样。连续传代干细胞始终保持着旺盛的生长力及扩增力。FASC结果表明，CD29、CD44、CD90的表达率随着传代的进行逐渐增高，P5-P6时表达最高，之后其表达率逐渐下降，免疫荧光检测发现P5-P6代干细胞在大鼠肝硬化模型中表达最强。结论随着传代BMMSCs的干性逐渐增强，传代至P5-P6时干细胞干性最强，随着传代的继续其干性逐渐下降。