脂质体介导转染N2a细胞的优化方法

背景:阳离子脂质体介导的细胞转染具有结果可靠、可重复性强的特点,但面临一个共同的缺点,就是转染效率常较低。目的:探讨阳离子脂质体转染N2a细胞(小鼠神经胶质瘤细胞)的优化方法。方法:采用24孔培养板,1.5μL阳离子脂质体Lipofectamine?LTX介导,通过贴壁法和悬浮法,将500 ng带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pcDNA3-GFP转入N2a细胞,倒置荧光显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况,并比较二者转染效率。采用悬浮转染法,将500 ng质粒DNA分别用1.0,1.5,2.0,2.5μL Lipofectamine?LTX进行转染,探讨最适脂质体和DNA比例。结果与结论:1.5μL脂质体/500 ng DNA,悬浮法转染效率显著高于贴壁法转染效率(P<0.01);1.0,1.5,2.0,2.5μL Lipofectamine?LTX对500 ng质粒DNA的转染效率分别为(76.60±3.85)%,(80.00±4.17)%,(88.00±5.89)%,(54.96±4.23)%,提示脂质体2.0μL与质粒DNA 500 ng的转染效率最高。

高密度悬浮转染方式高效获得重组杆状病毒

为了提高低代次重组杆状病毒的病毒滴度和获得足量低代次种子批,以最大程度满足产业化生产的需求,本研究以表达猪细小病毒(PPV)衣壳蛋白VP2的重组杆状病毒质粒(Bacmid)为研究对象,分别转染贴壁Sf9细胞和高密度悬浮ExpiSf9细胞。通过重组杆状病毒滴度测定、SDS-PAGE、Western blot以及血凝效价测定等方法,对获得的重组杆状病毒滴度和VP2蛋白表达量进行评价。结果表明,高密度悬浮转染获得的P0代重组病毒滴度、VP2蛋白表达水平和血凝效价均要高于贴壁转染方式,同时高密度悬浮转染可获得足量的P0代重组杆状病毒种子批,可为后续外源蛋白表达提供足量同质的低代次毒种,有效解决重组杆状病毒代次比较窄的问题,为后续重组杆状病毒相关产品的产业化生产奠定研究基础。