贵紫麦1号籽粒色素形成相关基因的差异表达

【目的】探明贵紫麦1号小麦灌浆期变紫后和变紫前2个时期籽粒的转录组差异,发掘影响贵紫麦1号花青素合成的关键基因和关键酶,丰富小麦籽粒色素转录组数据信息,为转录因子的克隆及表达提供参考。【方法】利用Illumina Hiseq 2000TM高通量测序技术对贵紫麦1号籽粒变紫前和变紫后2个时期进行转录组测序、文库构建及建库质量评估,对测序结果进行信息学分析。采用TTM对read count数据进行标准化处理,随后用DEGseq进行差异分析,设定q-value<0.005且|log2(fold change)|>1为阈值。通过筛选分析,获得两者间差异表达基因,按照无参转录组分析方法,对差异表达基因进行BLAST搜索,Nr数据库比对,GO功能富集及KEGG pathway分析,找出与花青素相关的关键基因和关键酶,并结合q RT-PCR验证所找到的关键基因及关键酶在不同时期的表达水平,掌握这些关键基因的信息。【结果】测序结果表明,贵紫麦1号变紫后和变紫前分别获得13.36 G和12.69 G的clean bases,clean reads为106 906 108条和101 547 534条,占原始序列的93.73%和94.90%。通过Trinity软件对所得clean reads进行拼接,共获得170 396条转录本,长度为119 020 625。拼接clean reads后获得119 572条Unigenes。在BLAST搜索中,119 572个高质量独特序列中有86 004条(71.92%)Unigenes与现有基因模型具有至少1个显著匹配。在Nr数据库比对结果鉴定了至少5种具有与来自节节麦、乌拉尔图小麦、二穗短柄草、大麦、小麦等已知基因同一性且序列相似性高的Unigenes。KOG数据库比对结果显示,注释成功的基因按KOG的26个group进行分类,注释在一般功能基因,蛋白质翻译后修饰与转运、分子伴侣及翻译、核糖体结构与生物合成等类别基因所占比重较大,分别为15.79%、14.51%和10.54%。643个差异基因中,236个呈上调趋势,407个呈下调趋势。GO注释表明,按照基因参与的生物过程、所处的细胞组分、具有的分子功能下一层级分类,共44个分类,差异基因显著富集在碳水化合物代谢过程(GO:0005975,16.03%)、应激反应(GO:0006950,10.83%)和水解酶活性分子功能(GO:0016787,34.84%)等类别中。KEGG pathway富集分析可知,353个差异基因富集到153条相关通路上,其中淀粉与蔗糖代谢、苯丙素生物合成、类黄酮生物合成等通路富集显著。类黄酮生物合成途径相关基因共66个,2条相关上调表达Unigenes,涉及查尔酮酶、隐色花色素双加氧酶2个关键酶基因,log2(fold change)分别为3.4164和2.1258。对所得关键基因进行q RT-PCR验证,证实查尔酮酶、隐色花色素双加氧酶在贵紫麦中1号中表达量呈明显上调趋势,与转录组测序分析结果一致,测序结果可靠度高。【结论】比较分析贵紫麦1号籽粒变紫后和变紫前2个时期转录组测序结果,获得大量Unigenes数据及差异表达基因相关信息,明确类黄酮代谢途径中2个关键酶基因(CHS和ANS)在调控贵紫麦1号籽粒花青素合成过程中作用显著。

普通小麦贵紫麦1号染色体的FISH核型分析

采用FISH(荧光原位杂交)技术,分析普通小麦贵紫麦1号染色体的FISH核型特点,为贵紫麦1号在小麦新品种选育上的应用提供参考。结果表明,贵紫麦1号包括21对染色体,pAs 1红色探针信号主要分布在A组和D组染色体上,pSc 119.2-1绿色探针信号则主要分布在B组染色体上;根据贵紫麦1号染色体上这2种探针的分布特征,可以准确辨识每条染色体。贵紫麦1号与硬粒小麦(AABB)在2A、5A、2B、3B及5B染色体上表现出pSc 119.2-1信号分布差异,与节节麦(DD)在染色体1D、4D及5D上也存在信号分布差异,与中国春(AABBDD)在2A、5A、6B、1D及7D染色体上的信号也各有不同,说明DNA重复序列在不同小麦材料之间具有多态性。

‘贵紫麦1号’生长素内输基因GzLAX3-1B的克隆及生物信息学分析

为了研究小麦生长素内输基因LAX3在小麦生长发育中的功能。本研究利用RT-PCR方法从‘贵紫麦1号’中获取GzLAX3-1B基因cDNA序列全长,并对该基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。结果显示:Gz LAX3-1B基因开放阅读框(ORF)为1 587 bp,编码528个氨基酸,具有PLN03074特异性位点,属于SLC5-6-like-sbd超家族。其编码的蛋白含有44个磷酸化位点和10个跨膜结构,是一种无信号肽的不稳定疏水性质膜蛋白。系统进化关系结果表明:‘贵紫麦1号’GzLAX3-1B基因与野生二粒小麦、大麦和油棕的亲缘关系最近。本研究结果为进一步开展小麦LAX3的生物学功能研究提供一定的理论基础和依据。

‘贵紫麦1号’GzA BI5-3A3基因的克隆及在烟草中的功能分析

ABI5在植物种子休眠与萌发、生长发育、花青素合成以及对逆境胁迫的响应等诸多生物学过程中起着重要作用。而大量研究表明ABI5参与种子休眠与萌发,少有研究表明ABI5参与花青素合成。为了探究ABI5转录因子参与调控小麦花青素合成,本研究从‘贵紫麦1号’中扩增得到Gz ABI5-3A3的c DNA全长。其启动子顺式元件分析结果表明Gz ABI5-3A3可能参与调控植物生长、光合作用、开花及种子萌发和花青素累积的生物学过程。蛋白质系统进化树分析表明,Gz ABI5-3A3与小麦中Ta ABI5D-SH-31、Ta ABI5D-SH-23和Ta ABI5D-SW-23同源。本研究进一步构建Gz ABI5-3A3基因的过表达载体PBI121-Gz ABI5-3A3,用于烟草遗传转化,共获得8个烟草转基因株系。本研究对Gz ABI5-3A3过表达转基因株系进行研究发现,转基因烟草株系L4、L7和L15苗期叶片中花青素含量显著低于野生型,其花青素合成途径的结构基因Nt PAL、Nt DFR、Nt ANS和Nt CHS的表达量显著下降。研究结果表明Gz ABI5-3A3能够通过调控花青素合成途径结构基因的表达来负向调控植物花青素的合成,为后续研究Gz ABI5-3A3调控花青素合成的分子机制提供研究基础。

小麦GzCIPK19基因的克隆及表达分析

植物在整个生命周期中,会遭遇各种非生物胁迫,这些非生物胁迫会对植物生理活动造成负面影响,CIPKs家族基因是一种存在于多数植物中的抗性基因,在非生物逆境胁迫中的信号传导中起着重要作用,因此,发掘并克隆小麦中的CIPKs家族基因,对小麦的抗逆育种工作具有重要意义。根据转录组测序结果,本研究筛选获得了GzCIPK19基因。在此基础上,本研究对该基因进行了克隆、生物信息学分析与表达分析。结果表明,Gz CIPK19基因CDS长1062 bp,编码353个氨基酸,具有CIPK-C特异性位点。其编码的蛋白含有34个磷酸化位点和1个跨膜结构,是一种无信号肽的不稳定亲水性质膜蛋白。系统进化关系结果表明:GzCIPK19与TaCIPK19在生物学功能上更为接近。表达分析结果表明GzCIPK19基因在根、茎、叶、籽粒中均有表达,其在叶中表达量最高。