一株克氏原螯虾病原——霍乱弧菌的分离鉴定

从尾扇边缘溃烂的克氏原螯虾中分离到一株优势菌LK-18,并对该菌株进行种属鉴定和致病性分析。通过菌落形态观察、16S rRNA测序、血清型分析及基因特性鉴定对细菌的类别进行初步判断,并采用浸泡感染、肌肉注射和腹腔注射等方式进行人工感染实验对细菌的致病性进行评估。经16S rRNA测序分析和4个管家基因(atp A、pyr H、rec A、gyr B)串联分析,该菌株最终被鉴定并命名为VibriocholeraeLK-18。V. choleraeLK-18经PCR鉴定不属于O1和O139血清型,但含hly毒力基因和几丁质分解相关的几丁质酶(chitinase,Chi)基因。人工感染实验虽未能重现烂尾症状,但从克氏原螯虾烂尾组织中分离的V. choleraeLK-18具有致病性,能够引起克氏原螯虾的死亡。研究结果表明霍乱弧菌LK-18是一种致病菌,不仅扩大了非O1/O139群霍乱弧菌的感染宿主范围,同时预警霍乱弧菌有导致克氏原螯虾养殖业暴发疾病的可能,因此要提前做好该疾病的预防工作,从而避免霍乱弧菌感染带来的损失。

一株牙鲆源哈维氏弧菌的分离鉴定及抗性研究

自秦皇岛昌黎养殖的患病牙鲆(Paralichthys olivaceus)体内分离获得一株革兰氏阴性菌,对其形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列进行分析,鉴定其为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi);对分离菌株进行了30种抗菌药的药敏试验和11株益生菌的拮抗试验,得出此分离菌株对米诺环素、左氧氟沙星、头孢他啶、氟苯尼考、头孢曲松、诺氟沙星、环丙沙星、强力霉素、复方新诺明等13种药物高度敏感,对克林霉素、青霉素、氨苄西林、林可霉素、苯唑西林等9种药物表现为不同程度的耐药性;地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌2种益生菌在一定浓度下对其具有拮抗作用。

宁德市南美白对虾副溶血弧菌的分离与药敏试验

为给宁德市南美白对虾(Penaeus vannmei)养殖病害提供精准用药依据,从7个海水养殖场南美白对虾体内分离病原菌,通过形态学观察、生理生化和16s rRNA鉴定,确定其分类地位,并进行药物敏感试验。结果表明,分离的9株病原菌在TCBS琼脂培养基中菌落均呈蓝-绿色,通过革兰氏染色镜检可见为革兰氏阴性菌,呈棒状、弧状、卵圆状,无芽孢。在氧化酶反应、葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、甘露醇、6%盐胨水、8%盐胨水、动力等8项试验中,结果呈阳性,确定为副溶血弧菌。9株副溶血弧菌对青霉素、新霉素、四环素等3种药物耐受比例较高,对恩诺沙星、呋喃唑酮、万古霉素等6种药物均高度敏感。

海洋费氏弧菌培养条件的研究

以本室保存的一株海洋费氏弧菌作为实验对象,采用单因素试验方法研究培养基起始pH值、盐浓度和摇瓶装液量等因素对菌株生长的影响,利用分光光度法测定其生长曲线,采用均匀设计方法,对该菌的培养基组分进行优化研究,确定其适合的生长条件,结果表明:当培养温度为30℃,通气量为180r/min时,该菌株在20h左右达到生长稳定期,对甘油的利用率要优于葡萄糖,盐浓度在5%以下时生长良好,最适装液量为60mL/250mL,培养液初始pH值为8.0。确定100mL培养基配方为:蛋白胨2g,酵母粉1.0g,氯化铵1.2g,氯化钠0.2g,磷酸二氢钾1.0g,此条件下可以得到最大的生物量。

二元含汞重金属混合物对费氏弧菌的联合毒性研究

以费氏弧菌（Vibrio fischeri）作为毒性测试物种,测定了Hg^2＋、Pb^2＋、Cu^2＋、Cd2＋、Zn^2＋、Cr^6＋对费氏弧菌的单一毒性;采用等毒性配比法研究了Hg^2＋/Pb^2＋、Hg^2＋/Cr^6＋、Hg^2＋/Cu^2＋、Hg^2＋/Zn^2＋、Hg^2＋/Cd2＋5种二元混合体系的联合毒性作用。结果表明,重金属离子单独存在时均会对费氏弧菌产生毒性作用,发光菌的相对发光强度均与重金属离子质量浓度呈负相关关系,线性相关系数为0.876 4-0.973 0。Hg^2＋、Pb^2＋、Cu^2＋、Cd2＋、Zn^2＋、Cr^6＋单独存在时对费氏弧菌的EC50分别为0.045 mg/L、0.181 mg/L、0.300 mg/L、0.117 mg/L、0.614 mg/L、23.000 mg/L,重金属离子毒性从大到小为Hg^2＋、Cd2＋、Pb^2＋、Cu^2＋、Zn^2＋、Cr^6＋。而与单一重金属相比,其二元混合物对费氏弧菌的生物毒性效应和强度完全不同。Hg^2＋/Pb^2＋、Hg^2＋/Cr^6＋二元混合体系表现为拮抗作用,Hg^2＋/Cu^2＋、Hg^2＋/Zn^2＋均表现为协同作用,Hg^2＋/Cd2＋表现为加和作用。

费氏弧菌急性毒性微孔板检测方法优化

为优化费氏弧菌(Vibrio fischeri)急性毒性微孔板法测试条件,以发光强度或发光抑制率为指标,研究温度、盐度、p H、反应体系、稀释比例、传代次数对费氏弧菌新鲜菌液生物毒性测试的影响。结果表明:费氏弧菌适宜培养温度为15~20℃;检测适宜温度为15℃,盐度为15‰~35‰,p H为5~10,检测体系为1∶10,传代次数不宜超过10代,不同稀释比例对新鲜培养的生长平台期费氏弧菌毒性测试无显著影响。基于优化后的方法,七水硫酸锌、氯化汞、十二烷基硫酸钠、苯酚对费氏弧菌急性毒性具有显著的剂量-效应关系,表明该优化方法适用于上述物质的毒性评价。

保护剂对费氏弧菌冻干粉复苏及毒性检测的影响

通过正交试验探究不同浓度脱脂乳、甘油和海藻糖组成的复合保护剂对费氏弧菌的保护作用,确定最佳保护剂配比,并进一步研究保护剂对冻干粉发光复苏特性和毒性检测准确性的影响。结果表明,15%脱脂乳、5%甘油和12.5%海藻糖组成的复合保护剂保护效果最好。添加保护剂后,干粉发光复苏稳定时间从传统的15 min缩短至5～10 min,并能准确检测4种金属的毒性大小。在最佳冷冻保护剂的保护下,费氏弧菌冻干粉在缩短了复苏时间的同时对金属的毒性检测没有影响,有利于费氏弧菌在环境监测中使用。

牛奶中土霉素对青海弧菌和费氏弧菌的毒性作用测定

本文通过应用费氏弧菌和青海弧菌,探究了牛奶中土霉素对这两种发光细菌的毒性抑制作用规律。牛奶中,一定浓度下,土霉素对青海弧菌生物发光的抑制率随作用时间呈对数趋势增加,在0.45mg/L作用下,该关系方程为y=0.3007ln(x)-0.1940,R2=0.9934;作用5min时,土霉素抑制率随着浓度变化的规律呈直线关系,之后呈对数关系,E50值在5min时为0.75mg/L,30min时降低至0.12mg/L;土霉素对费氏弧菌生物发光的抑制率随作用时间呈对数趋势增加,在0.55mg/L作用下,y=0.2742ln(x)-0.0942,R2=0.9961;其抑制率随着浓度变化的规律在5min呈指数关系,之后呈对数关系,在作用10min时,y=0.5524ln(x)+0.9045,R2=0.9949,E50值在5min时为0.75mg/L,40min时降低至0.09mg/L。

费氏弧菌综合毒性法对不同种类污染物的应急监测试验研究

以突发水环境污染事件中常见的重金属、农药和工业有机物三大类污染物为研究对象,利用海洋发光菌费氏弧菌进行发光菌综合毒性法试验研究。结果表明:采用冻干菌粉快速复苏技术对重金属、农药和工业有机污染物进行应急监测时,与发光菌的接触时间可用10min代替传统的推荐接触时间15min;重金属、农药以及工业有机污染物对费氏弧菌的发光抑制率随特定污染物浓度增加而增大,不同特定污染物对费氏弧菌的影响程度不同,可实现发光菌综合毒性法进行水质应急监测。

常见重金属对费氏弧菌的生物毒性研究

以费氏弧菌作为毒性测试物种,研究Hg2+、Pb2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+、Cr6+对费氏弧菌的生物毒性。同时,对相对发光强度和金属离子浓度进行线性回归后计算了EC50值(半数效应浓度值),并比较了该菌种对各金属化合物的敏感度差异。结果表明,发光菌的相对发光强度均与重金属离子浓度呈负相关,线性相关系数为0.8764~0.9730。Hg2+、Pb2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+、Cr6+对费氏弧菌的EC50分别为0.045、0.181、0.300、0.117、0.614、23.000 mg/L,毒性大小依次为Hg2+>Cd2+>Pb2+>Cu2+>Zn2+>Cr6+,可见Hg2+对费氏弧菌的毒性最大,但该发光菌对Cr6+的敏感性较小。

疏水性农药对费氏弧菌毒性的微板发光测定法研究

以费氏弧菌(Vibrio fisheri) 1H00021为毒性作用生物,以微孔板检测仪为发光强度检测设备,初步建立疏水性农药对费氏弧菌1H00021短期微板发光毒性测定方法。以甲醇为疏水性农药溶剂,每个微孔的毒性测定体系为200μL,包括30μL农药溶液、170μL费氏弧菌菌悬液,最佳检测时间为20 min。应用该方法成功地测定多菌灵、毒死蜱和溴氰菊酯等3种疏水性农药对1H00021的发光抑制毒性效应,拟合得到疏水性农药对1H00021毒性的剂量-效应曲线(dose-response curve,简称DRC),相关系数均大于0. 97。通过拟合的DRC参数,获得疏水性农药的半数效应浓度EC50。3种疏水性农药对费氏弧菌1H00021的发光毒性存在良好的剂量-效应关系,可以利用费氏弧菌微板发光法快速评价疏水性农药的生物毒性。

四环素对费氏弧菌产生生毒物兴奋效应(Hormesis)的时间关系和机制

以费氏弧菌(Vibrio fischeri,V.fischeri)作为受试生物,盐酸四环素作为研究对象,测定了盐酸四环素对V.fischeri在0—24 h的发光强度和细菌生长OD600的作用,并初步探讨了四环素对V.fischeri的Hormesis效应的作用机制.研究表明,盐酸四环素对V.fischeri的发光强度表现出了时间依赖型的Hormesis效应,即Hormesis效应出现在细菌生长的延滞期及平台期;根据V.fischeri的发光机制并结合量子化学计算结果,提出了盐酸四环素通过提供质子促进发光反应,从而产生Hormesis效应的可能机制.

克百威、镉和铜对费氏弧菌的联合毒性效应

通过费氏弧菌急性毒性实验,研究克百威、镉(Cd)和铜(Cu)三种受试样本及其混合样本(克百威-Cd和克百威-Cu的等毒性单位比为1∶1、1∶2、2∶1,克百威-Cd-Cu的等毒性单位比为1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1)对费氏弧菌15 min和30 min的急性毒性效应,计算克百威、Cd和Cu的单一和混合样本的半数效应浓度(Median effective concentration,EC50)。克百威、Cd和Cu暴露15 min的EC50值分别为101.29、13.11、47.06 mg·L^(-1),暴露30 min的EC50值分别为107.88、11.17、39.73 mg·L^(-1)。利用毒性单位(Toxicity unit,TU)法、相加指数(Additive index,AI)法和混合毒性指数(Mixtures toxicity index,MTI)法对混合样本进行了定性评价,结果表明:克百威与Cu和Cd两种重金属二元和三元复合作用后主要表现为部分相加和协同作用,说明二元和三元复合毒性较单一毒性增强,且不同混合比例下,联合毒性效应具有差异。TU法与MTI法的评价结果一致,而AI法的结果略有差异。

典型抗生素与群体感应抑制剂对费氏弧菌的三元慢性联合毒性

群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitor,QSIs)广泛应用之后与环境中现有抗菌药物共存的趋势不可避免。为了评价QSIs和现有抗菌药物共存所引起的生态环境效应,本文以费氏弧菌(Vibrio fischeri)作为模式生物,磺胺类抗生素磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺类增效剂甲氧苄嘧啶(TMP)和群体感应抑制剂4-溴-5-溴亚甲基-2(5氢)-呋喃酮(FC-30)为研究对象,测定了以上3个化合物对Vibrio fischeri的单一/混合慢性毒性效应。单一慢性毒性结果表明,3个化合物的毒性大小如下:FC-30<SCP<TMP,混合慢性毒性结果表明三元混合体系联合效应为拮抗。进一步分析可知,SCP+FC-30和TMP+FC-30两个混合体系的拮抗作用是三元混合体系为拮抗效应的根本原因。最后指出,因为SCP、TMP和FC-30的三元混合体系是拮抗作用,所以从环境生态风险角度分析,三者联合用药对环境的影响小于单一用药。

定性与定量评估4种重金属及2种农药混合物对费氏弧菌的毒性相互作用

重金属与农药共同暴露产生的联合毒性作用可以对实际环境产生潜在的风险。为了研究重金属与农药混合物在不同浓度比毒性相互作用(协同、拮抗与加和)及其定量评估相互作用大小,根据单个物质无观测浓度(NOEC)、5%效应浓度(EC5)、10%效应浓度(EC10)和50%效应浓度(EC50),设计3组混合物体系(即农药-农药、重金属-重金属和农药-重金属)分别按NOEC、EC5、EC10和EC50浓度比的12条混合物射线,测试单个化合物及混合物对以费氏弧菌的发光抑制急性毒性,利用浓度加和(CA)、独立作用(IA)、模型偏差比(MDR)及其观测值置信区间定性和定量评估12条混合物射线的毒性相互作用。结果表明,农药-农药二元混合物体系和农药-重金属六元混合物体系均产生明显的协同作用,其中农药-农药混合物体系中,混合物射线EE-NOEC在50%效应下协同作用大小达到30.6(MDRCA和MDRIA数值);混合物射线EE5、EE10的协同作用大小接近于混合物射线EE-NOEC,混合物射线EE50的效应大于15%时CA和IA计算的MDR值均在置信区间上限的上方,即混合物发生协同作用;农药-重金属混合物体系的4条混合物射线EE-NOEC、EE5、EE10和EE50在所有测试浓度水平的MDR值均在置信区间上限的上方,呈现出明显的协同作用;在50%效应下,混合物射线EE-NOEC、EE5、EE10和EE50的MDRCA和MDRIA值分别为4.05和4.91、6.12和7.98、3.70和4.60、2.62和2.59。重金属-重金属四元混合物体系除了EC50浓度比混合物表现出拮抗作用,其余混合物在所有测试浓度范围的MDR值均在置信区间范围内,均为加和作用。因此,混合物的毒性相互作用大小随着组分浓度比变化而发生变化。

发光费氏弧菌对常用色素的生物毒性评价

在探寻出色素与费氏弧菌发光抑制率存在相关性的基础上,初步建立起评价色素生物毒性的方法,并将其应用于果汁中色素产生的综合毒性的检验。结果:色素溶液质量浓度与发光抑制率呈正相关,相关系数在0.8760～0.9873之间,EC50范围在0.72～2.86mg/L之间;果汁中色素质量浓度与发光抑制率同样呈正相关,相关系数在0.9136～0.9951之间,EC50值在1.02～2.96mg/L之间。柠檬黄毒性较小,苋菜红毒性较大。果汁对人工合成色素的生物毒性具有一定影响。色素在果汁中对费氏弧菌发光抑制率随浓度增加而上升的幅度明显大于在水溶液中。本研究为食品急性生物毒性监测的研究提供初步参考。

中药抗菌剂对费氏弧菌的单一及联合毒性效应

抗生素滥用所导致的环境问题日益受到人们的关注,寻找传统抗生素的可能替代品迫在眉睫。从中药中提取的具有抗菌活性的化合物(简称中药抗菌剂)因具有资源丰富、抗菌谱广和不良反应低等特点,有望成为未来替代抗生素的关键。因此,有必要探究中药抗菌剂的毒性效应,这可以对未来中药抗菌剂使用后的生态风险提供指导。本文以费氏弧菌作为模式生物,分别测定了大黄素(emodin,EMO)、大黄酸(rhein,RH)、芦荟大黄素(aloe-emodin,AE)和双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)4种中药抗菌剂对费氏弧菌的单一和多元联合毒性,同时进行了抑菌作用机理的初步讨论。结果表明,4种中药抗菌剂对费氏弧菌的生物荧光均能产生较为明显的抑制作用,毒性排序是EMO>RH>AE>DHA。而当EMO、RH、AE和DHA混合暴露时,混合物在高浓度区间的联合毒性作用模式均为拮抗,推测是受试中药抗菌剂之间互相竞争性地对NADH脱氢酶产生抑制作用,从而导致对发光反应的抑制作用较单一暴露时减弱。本研究对未来中药抗菌剂单一及联合毒性效应的研究具有积极的推动作用,有望为今后中药抗菌剂的生态风险评价提供参考。

群体感应抑制剂对费氏弧菌生物荧光随时间变化Hormesis效应的机制探究

群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitor,QSIs)是作用于细菌群体感应系统的一类新型抗菌药物。目前关于QSIs引起Hormesis效应的机制探究较少。本文以费氏弧菌(Aliivibrio fischeri,A.fischeri)为模式生物,测定了3种高丝氨酸内酯(N-Acyl homoserine lactone,AHL)类QSIs(AHL-QSIs)对A.fischeri生物荧光的影响,发现AHL-QSIs对A.fischeri生物荧光产生了随时间变化的Hormesis效应。通过测定AHL-QSIs对A.fischeri生长量、相关蛋白表达量及模拟发光反应的影响,推测随时间变化Hormesis的机制如下:AHL-QSIs在低浓度时可以通过增强荧光素酶的活性进而促进个体发光反应,最终刺激A.fischeri的生物荧光;而当AHL-QSIs处于高浓度时,更多的AHL-QSIs不仅会通过改变细胞膜功能抑制细菌的生长,还可以与C6竞争结合LuxR影响荧光素酶的含量,最终抑制A.fischeri的生物荧光;AHL-QSIs对A.fischeri生物荧光的刺激作用和抑制作用会随细菌生长阶段状态的不同而发生变化,最终导致了随时间变化的Hormesis效应。研究结果可为今后AHL-QSIs的生态风险及其进一步的广泛应用提供一定的数据基础和理论依据。

铜、铬和敌敌畏对费氏弧菌的联合毒性效应研究

在实验室条件下,研究3种污染物质铜、铬和敌敌畏对费氏弧菌(V. fischeri)的单一毒性和联合毒性。单一毒性实验结果表明,3种污染物质对费氏弧菌的毒性大小为Cu^(2+)>Cr^(6+)>敌敌畏。利用毒性单位法、相加指数法和混合毒性指数法对混合样本进行定性评价,结果表明在二元混合体系中不同毒性单位的敌敌畏与Cu均表现为协同作用。敌敌畏与Cr的混合物毒性评价结果因评价方法不同而具有差异,TU法与MTI法的评价结果为部分相加作用,而AI法的结果为拮抗作用。敌敌畏-Cu-Cr的三元混合体系表现为部分相加作用和协同作用。

大口黑鲈源鳗弧菌的分离鉴定

为探明引起大口黑鲈(Micropterus salmoides)体表及内脏出血病的病原,本研究从发病大口黑鲈肝、脾、肾处分离病原,得到1株形态一致的优势菌株2004301,采用腹腔注射方式进行人工回感实验,证实菌株2004301能够引起养殖大口黑鲈内脏出血症状并死亡,且具有较强毒力。综合形态学观察、生理生化特性分析、基于16S rRNA基因和hsp 60基因构建的系统发育树及特异性基因检测结果,将菌株2004301鉴定为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。菌株2004301对32种药物的敏感实验证实其对恩诺沙星、氟苯尼考、磺胺甲恶唑、环丙沙星、氧氟沙星等抗菌药物敏感。