马属动物源十二指肠贾第虫流行研究进展

十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)是一种呈世界性分布的人兽共患寄生性原虫,主要寄生于人和多种哺乳动物的肠道内,造成宿主腹泻及生长发育迟缓等,严重危害畜牧养殖业发展和人体健康。加强对于十二指肠贾第虫的研究具有重要的公共卫生意义。论文对马属动物源十二指肠贾第虫的流行病学情况进行了总结,分析了不同地区、年龄、性别和养殖方式的马属动物感染十二指肠贾第虫的分布情况,阐明了不同风险因素对十二指肠贾第虫的流行率和基因型分布的影响,以期更好的了解十二指肠贾第虫在马属动物中的流行情况,为贾第虫病的综合防控提供参考。

十二指肠贾第虫包囊壁蛋白CWP2和CWP3的表达纯化与生物信息学分析

为体外表达与纯化十二指肠贾第虫包囊壁蛋白CWP2和CWP3并分析其生物信息学特征,本研究采用PCR从十二指肠贾第虫全基因组中扩增CWP2与CWP3基因,并构建重组表达载体p ET-28a-CWP2和p ET-28a-CWP3,经酶切与测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后超声破碎,采用尿素纯化蛋白并经SDS-PAGE和western blot检测重组蛋白的表达与纯化效果。SDS-PAGE结果显示,表达的重组CWP2和CWP3蛋白(rCWP2及r CWP3)分别为38.79 ku和27.38 ku,且两种重组蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后的蛋白条带单一且纯度均大于90%;western blot结果显示纯化的两种重组蛋白与His-tag单克隆抗体(MAb)的反应原性均较好。采用BCA法测定r CWP2及r CWP3的浓度分别为0.207 mg/mL及0.465 mg/mL。通过Prot Param、Prot Scale、Singal P 6.0、Deep TMHMM、NetPhos 3.1、SOPMA、SWISS MODEL和STRING等生物信息学软件预测这两个重组蛋白的生物信息学特性。结果显示,十二指肠贾第虫CWP2和CWP3分别为不稳定性和稳定性蛋白,有信号肽,无跨膜区,各有39个和25个磷酸化位点,均形成了氧化(O)-磷酸化。CWP2和CWP3的主要二级结构为α-螺旋和无规则卷曲;预测的三级结构模型中CWP2和CWP3与十二指肠贾第虫WB克隆C6株及P15株中的E2RTS7.1.A和E1F7Q8.1.A氨基酸序列的同源性分别达100%及90.69%。三级结构模型显示这两个蛋白也均以α-螺旋和无规则卷曲为主,与二级结构相符;CWP2与α-1贾第素、DNA解旋酶等7个蛋白存在相互作用关系;CWP3与α-2贾第素、δ-贾第素和β-贾第素存在相互作用关系。上述结果表明,本研究获得了高纯度高水平表达的r CWP2及r CWP3,且反应原性均较强,并分析了二者的主要生物信息学特征,为十二指肠贾第虫包囊壁蛋白的深入探究奠定了基础。

中国兔源十二指肠贾第虫分子流行病学研究进展

对中国兔源十二指肠贾第虫的分子流行病学研究进行了总结,分析了不同地区、年龄、品种、经济用途和饲养地点的兔源十二指肠贾第虫的感染情况,阐明了不同地区兔源十二指肠贾第虫的基因型分布情况,以更好地了解十二指肠贾第虫在家兔中的流行情况。兔源十二指肠贾第虫集聚体B具有广泛的宿主适应性特征,其宿主适应性的分子机制值得深入研究,也是今后的重要研究方向之一。

兔贾第虫病

贾第虫病是全世界危害人类健康的10种主要寄生虫病之一,且贾第虫可在人和多种动物间传播,国际上已将贾第虫病列入重要的人兽共患寄生虫病[1]。贾第虫又称小肠贾第虫(G.intestinalis)或十二指肠贾第虫(G.duodenalis),是全球分布的脊椎动物普遍存在的肠道原虫,主要引起以腹泻为主的肠道疾病,寄生于人及某些哺乳动物的小肠内,以十二指肠为多见。该虫主要通过食物或饮水传播,可引起动物腹泻,也是人类腹泻的常见病原。它也是一种机会致病性原虫。

蓝氏贾第虫无义mRNA的降解

无义介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作为细胞内的一种重要的mRNA质量监控机制,可以降解含有提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的异常转录本,从而避免截短蛋白质对细胞的毒害,但其详细的分子机制有待进一步阐释。蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)作为一种寄生性单细胞原生动物,进化地位特殊,对其NMD途径的研究有利于阐明基因表达调控的分子和进化机制。本研究通过酵母双杂交及体外pull-down实验分析了贾第虫NMD途径因子上游移码蛋白1 (Giardia lamblia up-frameshift 1,Gl UPF1)、贾第虫RNA结合蛋白(Giardia lamblia HRP1,Gl HRP1)、贾第虫核糖核酸外切酶(Giardia lamblia Ski7p,Gl Ski7p、Giardia lamblia XRN1,Gl XRN1)之间的相互作用关系。结果表明,Gl UPF1全长与Gl HRP1、Gl XRN1(1～500aa)、Gl Ski7p间均可发生相互作用。而且Gl UPF1的CH结构域和C端结构域分别与Gl HRP1、Gl XRN1(1～500 aa)、Gl Ski7p相互作用。说明Gl UPF1在贾第虫NMD途径中作为招募平台,在无义mRNA识别和降解过程中发挥重要作用。为此,结合本实验室之前的研究结果,我们提出原生动物贾第虫的NMD途径:在提前终止密码子处SURF(SMG1-UPF1-eRF1-eRF3)复合物形成后,Gl UPF1被磷脂酰肌醇3-激酶(suppressor with morphogenetic effect on genitalia 1,SMG1)磷酸化修饰,NMD途径激活,随后Gl UPF1与HRP1相互作用,将转录本标记为NMD底物; Gl UPF1进而招募下游贾第虫5'-3'核糖核酸降解酶Gl XRN1、贾第虫3'-5'核糖核酸降解因子Gl Ski7p,最终降解靶标mRNA。

贾第虫包囊壁形成及囊壁蛋白研究进展

十二指肠贾第虫(又称肠贾第虫或蓝氏贾第虫)是一种常见的人兽共患寄生性原虫,寄生于人、家畜和犬猫等多种哺乳动物的小肠,由其导致的贾第虫病被世界卫生组织列为危害人类健康但被忽视的疾病之一。贾第虫生活史简单,由具有致病性滋养体和感染性包囊两个时期组成。在不良环境(胆固醇缺乏、碱性pH和高浓度胆汁条件等)刺激下,贾第虫滋养体会分化形成感染性包囊。形成包囊对贾第虫的生存、病原传播和致病至关重要。贾第虫感染往往是由于宿主吞食了感染性包囊污染的食物和饮水所致。包囊壁是贾第虫包囊抵抗外界不良环境、维持其生存能力和感染活性的重要屏障。包囊壁约40%由蛋白质组成,其余为N-乙酰半乳糖胺等碳水化合物和脂类等。贾第虫包囊壁主要含3种囊壁蛋白(cyst wall protein,CWP):CWP1、CWP2和CWP3。囊壁蛋白不仅在维持包囊活力方面发挥重要作用,且在贾第虫病诊断、口服疫苗开发等方面具有重要价值。笔者综述了贾第虫包囊壁的组成和形成、包囊成囊的诱导及调节、囊壁蛋白在疾病诊断和疫苗方面的研究,以期为后续相关研究提供参考。

广东省部分地区奶牛十二指肠贾第虫的流行情况和分子特征分析

为调查广东省部分地区奶牛贾第虫的流行现状和分子特征,评估其人兽共患风险,从广东省3个地市采集366份奶牛粪便样本,基于贾第虫谷氨酸脱氢酶(gdh)和β-贾第素(bg)基因进行套式PCR,将测序所得序列进行Blast比对以确定基因型,运用Mega7.0软件的最大似然法构建进化树。结果共检出69份阳性样本,阳性率为18.85%。肇庆、广州和梅州奶牛群的阳性率分别为45.71%、16.27%和3.45%,不同地区差异显著(P<0.05)。育成牛感染率(25.96%)显著高于犊牛感染率(15%)。系统进化分析显示69份阳性样品中有11份为A1亚集聚体,29份属A1和E混合感染,29份为集聚体E的不同亚型。结果表明,广东省奶牛贾第虫感染率略高于国内大多数已知地区,不同地区和不同生长阶段的牛群感染率差异显著,广州市奶牛以A1为优势亚集聚体,应重视其可能引起的公共卫生问题。

十二指肠贾第虫谷氨酸脱氢酶原核表达及动力学分析

为探索十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis)谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)在滋养体中的分布和酶动力学等生物学特性,对GDH进行了克隆并构建原核表达质粒pET-28a-GDH,然后转化至BL21(DE3)plysS感受态细胞中经IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,以Ni 2+亲和层析纯化。对纯化的重组GDH进行体外酶动力学分析并免疫小鼠制备多克隆抗体,最后用间接免疫荧光技术对滋养体中的GDH进行定位。结果显示,贾第虫GDH的编码序列长1350 bp,试验成功构建pET-28a-GDH重组表达质粒并诱导表达,重组蛋白约为49.7 ku,且大部分以可溶性形式存在。ELISA和Western blot结果表明,贾第虫GDH具有良好免疫原性,获得的多克隆抗体具有较强特异性。间接免疫荧光定位显示GDH主要位于滋养体的胞质中。酶动力学研究结果显示,GDH最适反应pH约为9.3、最适温度约为42℃,对L-谷氨酸和NADP+的Km值分别为4.485 mmol/L±0.5062 mmol/L和119.5μmol/L±10.1μmol/L。研究结果为深入研究贾第虫GDH的生物学功能奠定了基础。

中国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长cDNA克隆及序列测定

从中国人源蓝氏贾第虫北京株 ( BEIJ88/ BTMR1/ 1)体外纯培养的电镜负染和超薄切片观察到蓝氏贾第虫病毒粒子。该病毒位于感染早期贾第虫的细胞质中 ,感染晚期的细胞核中。根据国外发表的蓝氏贾第虫病毒序列设计了 6对互相重叠的引物。用这 6对引物对从中国人源蓝氏贾第虫北京株发现的蓝氏贾第虫病毒基因组进行 RT- PCR,将产物连接到 p MD18- T载体中并转化入 DH5 α感受态菌 ,送上海生工测序 ,通过 BL AST对 Gen- Bank进行同源性搜索。结果测得我国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长为 6 2 73bp,与国外报道的蓝氏贾第虫病毒序列同源性为 95 % ,编码的氨基酸同源性为 90 %。

犬贾第虫dsRNA病毒的鉴定及特性

对分离到的 6株犬贾第虫 ( Giardia canis)包囊进行核酸分析 ,在其中 1株犬贾第虫核酸的琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到 1条长度约 7.0 kb的片段。经鉴定 ,该核酸不能被 DNA酶 ( 1 0 0 mg/ L)降解 ,对质量浓度低的 RNA酶 ( 0 .1 mg/ L)不敏感 ,但可被质量浓度高的 RNA酶 ( 1 0 mg/ L)降解。纯化包囊经液氮冻融后 ,磷钨酸负染 ,电镜观察发现有球形、直径约为 33nm的病毒样粒子存在 ,包囊超薄切片在胞质中也观察到该病毒样粒子存在。RNA依赖 RNA聚合酶活性测定结果表明 ,该病毒具有 RNA依赖 RNA聚合酶的活性。犬贾第虫 ds RNA病毒核酸经 RT-PCR扩增后得到 1条预计扩增大小的片段 ,将其回收后连接到 p MD1 8-T载体上进行克隆并测序 。

牛源蓝氏贾第虫环介导等温扩增检测方法的建立及应用

为建立一种适用于牛场或基层单位的牛源蓝氏贾第虫快速检测方法,根据NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的蓝氏贾第虫基因序列设计外引物(FIP,BIP)、内引物(F3,B3)和环引物(LB),建立了牛源蓝氏贾第虫的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对采集的40份犊牛新鲜粪便样品分别采用巢式PCR方法(贾第虫检测金标准)和建立的LAMP检测方法进行蓝氏贾第虫检测。结果显示:建立的牛源蓝氏贾第虫LAMP检测方法特异性良好,灵敏度高于巢式PCR;2种方法检测结果的符合率为100%。结果表明:所建立的LAMP检测方法可用于农场或基层单位的牛源蓝氏贾第虫检测。

1例人感染牛源E型蓝氏贾第虫病的诊断

蓝氏贾第虫是一种常见的人畜共患肠道寄生原虫,宿主感染后的主要症状有腹痛、腹泻及营养不良等。蓝氏贾第虫可分为8种基因型(集聚体A~H),其中集聚体E是感染牛、羊等偶蹄类动物的优势基因型。目前,常用的蓝氏贾第虫病治疗药物有甲硝唑、替硝唑、呋喃唑酮等。为了调查养殖业及生物检测行业从业人员贾第虫感染情况及评估其感染风险,本研究通过镜检与巢式PCR(基于BG、GDH、TPI位点)技术对本实验室与牛羊接触频繁的20位成员进行粪便检测。镜检未见任何寄生虫虫卵或虫体,而基于BG基因的巢式PCR扩增后1份样品定性为阳性,阳性率为5%。对该样品进行测序发现其基因型为牛源E型,经进化发育分析发现其与人易感的A型集聚体发育距离较近,可能存在较大的人畜传播风险。

水中贾第虫包囊的检测和杀灭及清除方法

贾第虫病是一种水源性疾病,呈世界性分布,近年来在世界各地发生了多起本病的暴发流行,饮用水被含有贾第虫包囊的粪便污染是造成本病流行的主要原因。本文对贾第虫病的病原学、流行概况、水污染情况、直接和间接水源性传播进行了简介,重点介绍了水中贾第虫包囊的检测、包囊活性鉴定、杀灭与清除方法及地震、洪水、海啸等自然灾害过后饮用水的简易处理方法。

人源蓝氏贾第虫病毒GLV1518-2322基因的表达及表达产物抗血清的制备

根据中国人源蓝氏贾第虫病毒 (GLV)全基因组测序结果 ,将其全基因组cDNA上编码贾第虫病毒部分衣壳蛋白的GLV1 5 1 8 2 3 2 2基因克隆到原核表达载体pET 2 8c ( +)上 ,构建了原核表达重组质粒pET 2 8c( +) GLV1 5 1 8 2 3 2 2。SDS PAGE分析表明 ,经IPTG诱导 ,3 2kDa蛋白基因在大肠杆菌BL2 1 (DE3 )pLysS中得到高效表达。以纯化的表达产物为抗原 ,免疫BalB c小鼠 ,同时用病毒粒子免疫BalB c小鼠 ,制备了中国人源蓝氏贾第虫病毒GLV1 5 1 8 2 3 2 2蛋白特异性抗血清 ,ELISA方法测得的纯化蛋白最适抗原包被浓度为1 40 0和病毒粒子抗血清最佳工作浓度为 1 2 0 0。

贾第虫研究──Ⅰ．西蒙氏贾第虫（Giardia simoni）滋养体和包囊对实验动物的感染

作者从自然感染西蒙氏贾第虫（Ｇｉａｒｄｉａｓｉｍｏｎｉ）的金黄地鼠肠道内和粪便中分离、收集滋养体和包囊，分别经口感染大鼠、小鼠、豚鼠和兔子。结果表明兔子和脉鼠均不感染，大鼠、小鼠均不同程度地感染该虫，且４周龄大鼠比８周龄大鼠更易感（Ｐ＜０．０５），而在小鼠中成年鼠与老年鼠对西蒙氏贾第虫的敏感性没有差异（Ｐ＞０．０５）。滋养体在感染动物的肠道内主要分布于十二指肠前段，中前段和中段。同时观察到结肠和直肠内有包囊，这表明该虫在大鼠、小鼠体内完成了其生活史。作者还对感染前后的滋养体作了蛋白银和铁苏木精染色比较，二者在形态上完全相同。

犬贾第虫感染的诊治

犬的贾第虫病是由犬贾第鞭毛虫寄生于犬小肠内引起腹泻的一类肠道原虫病。贾第虫具有人犬互传的可能性，人源和犬源贾第虫基因具有相似性，因此犬的贾第虫病已引起国外兽医的普遍重视。在国内因为贾第虫致病力弱、临床症状不明显加之国内检测手段的制约，对该病重视不足。临床上常会发生误诊、漏诊现象。笔者查阅国内外相关资料并结合自己的临床经验，对即墨一藏獒养殖场3窝幼犬同时爆发以持续下痢为主要症状的传染病确诊为贾第虫感染。

贾第虫长爪沙鼠动物模型某些问题的研究

以来自感染儿童贾第虫包囊感染长爪沙鼠的结果表明,5个包囊即可使12.5％的沙鼠受染。感染率随灌注包囊量增加而升高。10~4个包囊时,感染率可达100％。多数受染沙鼠呈间歇性排包囊。小肠中滋养体数及分布与病程有关,与粪便排虫量无对应关系。贾第虫不侵袭肠组织,但能引也小肠典型炎症改变,如绒毛上皮坏死脱落、肠腺细胞分裂相增加和绒毛长度/腺体长度比值下降。

中国贾第虫感染流行病学现况

１９８８～１９９１年对全国３０个省（区、市）中７２６个县的１４７７７４２人进行的贾第虫感染调查，总感染率为２．５２％，呈全国性分布，以新疆（９．２６％）、西藏（８．２２％）和河南（７．１８％）为高，而吉林、辽宁、内蒙古等则甚低。人体感染率在２％以内的县占４９．８％，高于１０％的县仅占５．５％。年龄以５～９岁组（４．９７％）为最高，次之为１０～１４岁组（４．１７％）。男性（２．７９％）高于女性（２．５２％）。职业以牧民、儿童为高。新疆、广东、河北、四川、福建的感染有家庭聚集性。饮用水以涝坝水的感染率最高（１３．９４％）。

我国首株牛源贾第虫的分子鉴定

目的通过16S及内转录间区(ITS)rDNA基因序列的扩增、克隆以及序列分析,从分子水平对首次在我国分离的一株牛源贾第虫进行种类及基因型鉴定。方法根据GenBank中登录的贾第虫rRNA基因序列,设计引物,采用热启动-降落PCR方法从牛源贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段,经TA克隆至pMD18-T载体后测定其核苷酸序列,然后进行序列分析。结果成功地扩增出该株牛源贾第虫的16S rRNA全基因及rDNA ITS序列,大小为1 715 bp,包括1 447 bp的16S rDNA全长序列和243 bp的ITS间区序列,以及25 bp的26S rDNA基因5'末端。序列分析表明此牛源贾第虫为E型蓝氏贾第虫。结论本研究从分子水平鉴定我国首株牛源贾第虫为蓝氏贾第虫(E型),并首次报道了该虫株的rDNA 16S及ITS序列,为牛源贾第虫的进一步研究奠定了基础。

无核仁原生动物蓝氏贾第虫rDNA的分布

过去的工作已表明 ,源真核生物 (Archezoa)中的双滴虫类极其原始 ,核中尚无核仁发生 ,以蓝氏贾第虫 (Giardialamblia)作为双滴虫类的代表 ,用高度特异的核仁组织区银染法 (改良的Ag Ⅰ法 ,李靖炎 ,1985 )在电镜下检视其rDNA在核中的分布。结果发现 ,代表rDNA之所在的银粒并不集中形成任何类似核仁组织区或核仁纤维区的结构 ;在作为对照的小眼虫 (Euglenagracilis)体内 ,银粒则完全集中在核仁纤维区中 ,因此 。