组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶KDM1家族在肝细胞癌中的作用

肝细胞癌(HCC)作为临床最常见的消化系统恶性肿瘤,占所有肝脏恶性肿瘤患者的85%~90%[1]。HCC患者的5年生存率为17%~20%,位居癌症相关死亡原因第4位,目前全球每年约有84万新增HCC病例,且这一趋势仍在进行性上升[2,3]。该病发病隐匿,早期缺乏典型临床症状和特异性检测指标,被发现时通常已处于晚期阶段,并且由于目前治疗手段有限,费用高昂,俨然成为了影响公众健康的社会难题。目前分子靶向免疫治疗在HCC治疗中取得了突破性进展,是肝病领域的研究热点之一,不断深入挖掘HCC进展过程中的调控分子,为新型抗癌药物的研发提供潜在治疗靶点,是今后肝病学科攻坚的重点方向。

赖氨酸特异性的去甲基化酶3A对内皮祖细胞功能的影响

目的探讨赖氨酸特异性的去甲基化酶3A(KDM3A)对内皮祖细胞(EPCs)增殖、迁移、管形成能力及分泌促血管生成细胞因子功能的影响。方法从同基因型成年雄性SD大鼠的后肢长骨中分离出骨髓单核细胞,EGM-2培养基诱导形成EPCs,将EPCs按完全随机设计的方法分为3组:空白组、Ad-GFP转染对照组和Ad-KDM3A转染处理组。分别用CCK-8、Transwell检测EPCs的增殖和迁移能力,基质胶检测EPCs的管形成能力。免疫印记法检测KDM3A蛋白的表达及EPCs分泌血管内皮生长因子(VEGF)和基质细胞衍生因子1(SDF-1)蛋白表达量,同时检测调控分泌机制相关的丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt)、p-Akt蛋白的表达。结果与Ad-GFP转染对照组比较,Ad-KDM3A转染处理组下调KDM3A的表达可显著增强EPCs的增殖能力(1.393±0.058比1.031±0.059)、迁移能力(1.89±0.12比1.21±0.11)和管形成功能(1.552±0.109比1.027±0.038),同时EPCs合成和分泌的促血管生成细胞因子VEGF(0.738±0.029比0.153±0.003)和SDF-1(0.333±0.013比0.163±0.005)增多。与Ad-GFP转染对照组比较,Ad-KDM3A转染处理组下调KDM3A可使Akt蛋白表达增加(0.553±0.005比0.169±0.001)。结论下调KDM3A蛋白的表达可增强EPCs的增殖、迁移、管形成能力及分泌促血管生成细胞因子的功能,这可能与增加Akt蛋白表达有关。

27位氨基酸三甲基化的组蛋白3(H3K27me3)及其修饰酶在小鼠不同组织中分布

目的研究出生后7日龄和2月龄小鼠各组织器官中27位氨基酸三甲基化的组蛋白3(H3K27me3)的水平及其修饰酶Zeste基因增强子同源物2(EZH2)、赖氨酸特异性脱甲基酶6B(Kdm6B/JMJD3)和赖氨酸特异性脱甲基酶6A(Kdm6A/UTX)的表达。方法免疫组织化学染色法检测7日龄和2月龄小鼠脑、涎腺、背部脂肪、胸腺、肺、心脏、胃、肠、肝、睾丸、皮肤组织中H3K27me3、EZH2、JMJD3和UTX表达,实时定量PCR验证,统计分析H3K27me3水平与EZH2、JMJD3和UTX表达之间的关系。结果 H3K27me3在7日龄和2月龄小鼠被检测组织中均持续存在;EZH2在7日龄和2月龄小鼠脑、心肌、肝及皮肤中表达,但仅在2月龄小鼠涎腺、肠、睾丸、肺、脂肪组织、胸腺中持续表达;JMJD3在7日龄小鼠脑、皮肤、涎腺、心肌、肠、睾丸、肺、脂肪组织、胃中表达,但在2月龄小鼠的肺、脂肪组织、胃中不再表达;UTX在7日龄小鼠的脑、皮肤、涎腺、心肌、睾丸、肺及脂肪组织中表达,但仅在2月龄小鼠睾丸中表达;大部分免疫组织化学染色阳性的H3K27甲基调节酶相应的mRNA呈中等或较高水平表达。结论 H3K27me3在小鼠不同时期各组织中均持续存在;EZH2多存在于2月龄小鼠脑、皮肤、涎腺、心肌、肠、睾丸、肺、脂肪组织、肝、胸腺;JMJD3、UTX多存在于7日龄小鼠脑、皮肤、涎腺、心肌、睾丸、肺、脂肪组织;H3K27me3分布与EZH2的表达之间无明显一致关系,与JMJD3或UTX不存在明显反向分布关系,EZH2与JMJD3或UTX的表达分布也不存在反向关系。提示EZH2、JMJD3和UTX在小鼠出生后多种组织中可能起重要作用;在体内H3K27me3水平及其修饰酶可能受多因素控制,以完成复杂的生理功能。

H3K36me3及其表观遗传修饰蛋白质SETD2和KDM4B在结直肠癌中的临床病理意义

目的:组蛋白修饰是表观遗传调控的一种重要形式。其中,组蛋白甲基化是染色质状态的关键决定因素。组蛋白H3第36位赖氨酸三甲基化产物(histone H3 trimethylation at lysine 36,H3K36me3)可以介导多种转录相关事件,有助于DNA损伤修复。组蛋白赖氨酸三甲基转移酶SET结构域2(SET domain containing 2,SETD2)、赖氨酸特异性去甲基化酶4B(lysine-specific demethylase 4B,KDM4B)分别是H3K36me3甲基转移酶及去甲基酶,SETD2失活及KDM4B活化均可下调H3K36me3水平从而促进肿瘤的发生和发展。本研究主要探讨H3K36me3、SETD2、KDM4B在结直肠癌中表达的临床病理意义。方法:收集2018年10月至2020年10月就诊于福建中医药大学附属人民医院的80例结直肠癌患者术后石蜡包埋的组织样本。采用免疫组织化学染色法检测H3K36me3、KDM4B、SETD2及4种错配修复(mismatch repair,MMR)蛋白质(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2)在结直肠癌及正常肠黏膜中的表达水平。采用多重荧光PCR-毛细管电泳检测结直肠癌及正常肠黏膜的微卫星状态,分为微卫星高度不稳定性(microsatellite instability-high,MSI-H)组与微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)组,检测2组结直肠癌中H3K36me3及SETD2、KDM4B、MMR蛋白质表达情况并分析其临床病理意义。结果:STED2、H3K36me3表达与结直肠癌发生呈负相关(分别为r=-0.745,P<0.001;r=-0.160,P<0.05),KDM4B表达与结直肠癌发生呈正相关(r=0.660,P<0.001)。不同的患者性别、年龄,不同的肿瘤发生部位、大体类型、肿瘤最大径、浸润深度、淋巴结转移的临床病理参数之间SETD2及H3K36me的表达差异均无统计学意义(均P>0.05),除在不同的肿瘤浸润深度KDM4B的表达差异有统计学意义(χ^(2)=0.349,P<0.05)外,在其他临床病理参数上KDM4B的表达差异均无统计学意义(均P>0.05)。结直肠癌样本中检测出14例为MSI-H结直肠癌、66例为MSS结直肠癌;SETD2及H3K36me3的表达均与结直肠癌微卫星状态相关(分别为χ^(2)=3.916,P<0.05及χ^(2)=41.608,P<0.001);KDM4B的表达与结直肠癌微卫星状态无明显相关性(χ^(2)=0.067,P>0.05)。SETD2及H3K36me3表达与MSI-H结直肠癌发生呈负相关(分别为r=-0.221,P<0.05及r=-0.721,P<0.001)。KDM4B表达与MSS结直肠癌发生呈正相关(r=0.200,P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示13例(16.25%)为dMMR,67例(83.75%)为pMMR;PCR-毛细管电泳验证结果显示14例为MSI-H结直肠癌,其中13例为dMMR,1例为pMMR;66例为MSS结直肠癌。免疫组织化学染色与多重荧光PCR-毛细管电泳检测结果具有强一致率(Kappa=0.955)。结论:H3K36me3及其表观遗传修饰蛋白质SETD2和KDM4B蛋白质的不同表达程度与结直肠癌发生、发展具有相关性。

赖氨酸特异性去甲基化酶1增强胰腺癌PanC1细胞E3泛素连接酶对p16的抑制作用

目的观察胰腺癌PanC1细胞中组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）对E3泛素连接酶（Ring1B）抑制抑癌基因p16转录及表达作用的影响。方法通过采用短发夹RNA（shRNA）分别在PanC1细胞中敲除Ring1B（重复2组为shRing1B#1、#2）和LSD1基因（shLSD1#1、#2），未敲除组为shLuc，分别通过实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）和Western blot检测PanC1细胞LSD1、Ring1B和p16基因的表达；而后通过质粒转染过表达Ring1B，再敲除LSD1基因，检测PanC1细胞p16的表达。结果Ring1B基因敲除后RT-qPCR结果显示p16 mRNA转录增加，shRing1B#1、shRing1B#2（4.613±0.416、4.615±0.224）高于shLuc（1.010±0.032）（P＝0.000）；Western blot结果显示Ring1B基因敲除组p16蛋白表达增加；LSD1基因敲除后p16 mRNA转录和蛋白表达也增加，shLSD1#1、shLSD1#2组和shLuc组对应数值分别为4.704±0.503、3.885±0.011和1.008±0.027（P＝0.005）。Ring1B过表达的PanC1细胞中（Ring1B组），LSD1敲除组shLSD1＋vector组（5.893±0.986）高于对照组shLuc＋vector组（1.010±0.201）；shLSD1＋Ring1B组（0.695±0.031）高于shLuc＋Ring1B组（0.156±0.016）（P＝0.001）。结论LSD1与Ring1B协同作用，共同参与抑制胰腺癌p16的转录表达；LSD1能够增强Ring1B抑制p16转录的作用。

敲低KDM3A抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的侵袭迁移并将细胞周期阻滞于G0/G1期

目的研究赖氨酸特异性去甲基化酶3A(KDM3A)对MDA-MB-231乳腺癌细胞侵袭与迁移的影响。方法采用实时定量PCR及Western blot法分别检测MDA-MB-231乳腺癌细胞与MCF-10A正常乳腺细胞KDM3A的mRNA和蛋白表达;采用KDM3A短发夹RNA(shKDM3A)慢病毒感染MDA-MB-231细胞敲低其KDM3A水平,Transwell^(TM)实验检测MDA-MB-231细胞的侵袭与迁移能力的改变,流式细胞术检测细胞周期的变化。结果与MCF-10A上皮细胞相比,乳腺癌MDA-MB-231细胞KDM3A表达明显增加;敲低KMD3A后,MDA-MB-231细胞的侵袭与迁移能力显著下降,细胞周期阻滞于G0/G1期。结论敲低KDM3A抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的侵袭与迁移并将细胞周期阻滞于G0/G1期。

miR⁃29a⁃3p靶向KDM5B调控肾透明细胞癌增殖和侵袭

目的探究miR-29a-3p通过调控赖氨酸特异性去甲基化酶5B(lysine-specific demethylase 5B,KDM5B)的表达对肾透明细胞癌(kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)增殖和侵袭的影响及临床意义。方法通过TCGA数据库数据分析不同分期KIRC患者中KDM5B的表达情况及对KIRC预后生存的影响;并利用TCGA数据分析不同分期KIRC患者中miR-29a-3p的表达情况及与KDM5B表达的相关性。采用脂质体转染技术分别将miR-29a-3p mimics、mimics-NC和miR-29a-3p inhibitor转染到KIRC 786-O和Caki-1细胞中,并定义为miR-29a mimic组、mimics NC组和Inhibitor组,采用RT-qPCR检测miR-29a-3p和KDM5B的表达水平,MTS检测细胞增殖能力,Transwell检测细胞侵袭能力。利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-29a-3p和KDM5B的靶向关系。结果TCGA数据库分析结果显示,不同分期KIRC患者中KDM5B的表达差异最明显,KDM5B明显影响KIRC患者的预后(HR=2.882,P<0.001)。与KDM5B结合的miR-29a-3p在不同分期KIRC患者中表达差异最明显(P<0.001),且与KDM5B相关性最强(r=-0.283,P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验证实miR-29a-3p可与KDM5B特异结合。过表达miR-29a-3p后,786-O、Caki-1细胞中KDM5B表达水平下调,细胞增殖能力下降,穿膜细胞数减少(均P<0.05);沉默miR-29a-3p后,KDM5B表达水平上调,细胞增殖能力升高,穿膜细胞数增多(均P<0.05)。结论miR-29a-3p可能通过下调H3K4去甲基化酶KDM5B的表达抑制KIRC细胞系786-O、Caki-1的增殖和侵袭。

Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族成员3对非小细胞肺癌侵袭转移的影响及机制研究

目的:探究Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族成员3(WASF3-AS1)对非小细胞肺癌(NSCLC)侵袭转移的影响及机制。方法:选取26例临床不同病理分期NSCLC患者的癌组织和癌旁组织,以及NSCLC细胞系NCI-H1975细胞和正常肺支气管上皮细胞系HBE细胞为研究对象。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测上述临床组织和细胞系中WASF3-AS1、赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)、组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)、E-钙黏蛋白(E-ca)、N-钙黏蛋白(N-ca)的表达。采用CCK-8实验检测细胞增殖。采用划痕实验检测细胞迁移能力。采用Transwell实验检测细胞侵袭能力。采用Western blot检测LSD1、HDAC6、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)、蛋白激酶B(AKT)、E-ca和N-ca的表达。结果:与对照组比较,在NSCLC组织和细胞中,WASF3-AS1、LSD1、HDAC6、PTEN和E-ca低表达,AKT和N-ca高表达(均P<0.05);WASF3-AS1过表达能够促进LSD1和HDAC6并抑制PTEN/AKT信号,进而抑制NCI-H1975细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化(均P<0.05)。结论:ASF3-AS1可能通过招募LSD1和HDAC6到靶基因PTEN启动子区发挥抑制NSCLC细胞侵袭转移作用。

重组蛋白KDM4D对水牛成纤维细胞生长及组蛋白甲基化修饰的影响

本研究旨在探讨重组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶4D(lysine K-specific demethylase 4D,KDM4D)对水牛成纤维细胞(buffalo fetal fibroblasts,BFFs)生长及组蛋白甲基化修饰的影响,为提高水牛体细胞重编程效率提供理论基础。首先,使用不同浓度的重组蛋白KDM4D处理BFFs,摸索出最适宜的处理浓度和处理时间。其次,采用实时定量PCR技术和EdU方法检测重组蛋白KDM4D对BFFs增殖凋亡的影响。最后,使用细胞免疫荧光和Western blot对组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化(histone 3 lysine 9 trimethylation,H3K9me3)修饰水平和异染色质蛋白1α(heterochromatin protein 1α,HP1α)基因的表达水平进行检测。结果发现,适宜浓度的重组蛋白KDM4D(0.10μg/mL)处理36 h对BFFs形态无明显影响,可以显著提高细胞活力(P<0.05)。实时定量PCR分析结果显示,与对照组相比,重组蛋白KDM4D可以显著提高细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)和B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma 2,BCL2)的mRNA相对表达水平,显著降低Bax(BCL2 associated X)的mRNA相对表达水平(P<0.05)。EdU细胞增殖检测结果表明,重组蛋白KDM4D处理后BFFs的增殖率显著高于对照组的(P<0.05)。细胞免疫荧光和Western blot结果显示,培养基中添加重组蛋白KDM4D后,BFFs的H3K9me3修饰水平和HP1α蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。上述结果表明,适宜浓度的重组蛋白KDM4D(0.10μg/mL)处理36 h,可以促进BFFs的增殖,降低BFFs的H3K9me3修饰水平和HP1α蛋白的表达水平。本研究为进一步探讨重组蛋白KDM4D对水牛体细胞重编程的作用机制提供了理论依据。

去甲基化酶UTX的作用机制

组蛋白H3第27位赖氨酸的2和3甲基化(di-and tri-methylated histone 3 lysine 27,H3K27me2/3)是抑制性组蛋白标记,在发育、增殖分化调控中起关键作用。赖氨酸特异性去甲基化酶6A(lysine-specific demethylase 6A,KDM6A),也称UTX(the ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat on chromosome X),是特异性催化H3K27me2/3去甲基化的酶,参与了转录激活、调控基因表达的过程。研究发现,除了参与H3K27me2/3去甲基化过程外,UTX还参与形成了COMPASS复合体、SWI/SNF复合体以及与转录因子相互作用等生物学过程,具有多种复杂的酶促和非酶促功能。基因敲除实验证明,UTX是干细胞诱导及胚胎发育调控所必需的,而UTX在疾病中的作用及机制也日益受到重视。由于UTX参与了增殖分化调控,较多的研究关注UTX在肿瘤中的作用。在不同的肿瘤类型中,UTX可能起到致癌或抑癌的双重作用,但其内在分子机制仍需进一步探讨。心血管疾病中,UTX参与心肌再生激活,可能起到保护作用;然而UTX又通过激活病理性基因表达,促进肾脏疾病的发生发展等。鉴于UTX在发育及相关疾病中的重要作用,其靶点药物研发也成为了研究热点。因此,本文就UTX的作用机制最新研究进展作一综述。

慢病毒介导干扰LSD1基因的卵巢癌稳转细胞株的构建及鉴定

目的构建并鉴定慢病毒介导干扰赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)基因的卵巢癌稳转细胞株,为深入研究以LSD1为靶点的表观遗传学抗肿瘤治疗奠定基础。方法扩增并抽提所需质粒,紫外分光光度计检测质粒纯度,计算A260/A280。采用Lipofectamine 2000脂质体转染法将质粒转染入人肾上皮细胞293T,取转染THM质粒后的293T细胞,在倒置荧光显微镜下观察转染情况;分别取转染目的质粒和PLKO空载体质粒后的293T细胞,收集病毒上清液,感染人卵巢癌SKOV3细胞(分别记为观察组和对照组),筛选出稳转细胞株。观察组经浓度梯度(0、1、10、100、1 000 ng/m L)多西环素诱导,以及两组均经100 ng/m L多西环素诱导后,采用Western blotting法检测LSD1及其特异性反应底物H3K4me1、H3K4me2蛋白相对表达量。结果目的质粒A260/A280在2.0左右,说明纯度较高;THM质粒转染293T细胞呈绿色荧光,为真核载体表达的绿色荧光蛋白,表明成功转染。随着多西环素浓度的升高,观察组诱导后LSD1蛋白相对表达量均逐渐降低,H3K4me1、H3K4me2蛋白相对表达量逐渐升高,各浓度间比较有统计学差异(P均<0.01)。观察组经100 ng/m L多西环素诱导后LSD1蛋白相对表达量均明显低于同组诱导前及对照组诱导后,H3K4me1、H3K4me2蛋白相对表达量明显高于同组诱导前及对照组诱导后(P均<0.01)。结论成功构建慢病毒干扰下调LSD1基因表达的卵巢癌稳转细胞株,并经不同浓度多西环素诱导鉴定;该细胞株可用于以LSD1为靶点的表观遗传学抗肿瘤治疗研究。

揭示LSD1在胚胎干细胞分化中起关键作用的机制

据Whyte WA2012年2月1日（Nature，2012Feb1．doi：10．1038，naturel0805）报道，一种赖氨酸特异性去甲基酶1（1ysine-spec-ific demethylase 1，LSDl）在胚胎干细胞分化为其他细胞类型时发挥着关键性作用。 LSDl是一种组蛋白去甲基酶,作用在组蛋白H3特异性赖氨酸残基上，从而改变染色体DNA上基因转录。

乌司他丁对烫伤大鼠脑组织的保护作用及其可能机制

目的 探讨乌司他丁对烫伤大鼠脑组织的保护作用及其可能机制.方法 40只雄性SD大鼠按随机数字表法随机分为单纯烫伤组和乌司他丁组各20只,均造成50％总体表面积Ⅲ度烫伤,烫伤后即刻分别静脉注射生理盐水和乌司他丁4万U/kg.于烫伤后6h和24h断脑取材,用酶联免疫吸附（ELISA）法检测脑组织神经元特异性烯醇化酶（NSE）和热休克蛋白70（HSP70）的含量,Western印迹法测定脑组织中乙酰化组蛋白H3赖氨酸9（Ac-H3K9）表达,干／湿重法测定脑组织含水率.结果 伤后6h乌司他丁组脑组织匀浆中NSE含量和脑组织含水率均显著低于单纯烫伤组[（146＆#177;11）比（156＆#177;13） pg/ml和（77.3＆#177;1.9）％比（79.0 ＆#177;2.2）％],HSP70含量和Ac-H3K9相对表达量均显著高于单纯烫伤组[（99士19）比（92＆#177;13） pg/ml和（1.26＆#177;0.37）比（0.57＆#177;0.23）]（均P＜0.05）.伤后24 h乌司他丁组NSE含量显著低于单纯烫伤组[（141＆#177;14）比（159＆#177;10） pg/ml,P＜0.05],而含水率、HSP70含量、Ac-H3K9表达水平差异均无统计学意义[（75.9＆#177;1.2）％比（76.5＆#177;1.4）％、（118＆#177;17）比（102＆#177;16） pg/ml、（2.31＆#177;0.27）比（1.87＆#177;0.31）,均P＞0.05].结论 乌司他丁能减轻致死性烫伤大鼠早期的脑组织损害,可能与其能增加脑组织保护性蛋白表达有关.