牙龈素提取物对小鼠脑神经炎症的影响

目的·观察牙龈素提取物对小鼠脑神经炎症的影响。方法·采用超声破膜结合低温超速离心,并通过超滤浓缩的方法从牙龈卟啉单胞菌ATCC33277获得牙龈素提取物。对牙龈素提取物进行蛋白定量后行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,经湿转法转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,封闭后分别使用赖氨酸特异性牙龈素(lysine-gingipain,Kgp)抗体和精氨酸特异性牙龈素(arginine-gingipain,Rgp)抗体对样本进行孵育,以检测提取物中的牙龈素免疫原性。通过向C57BL/6N小鼠腹腔注射牙龈素提取物建立小鼠牙龈素急性感染模型。在小鼠腹腔注射牙龈素提取物后的不同时间点,分别采用针对Kgp和Rgp的特异性荧光底物Z-His-Glu-Lys-MCA和Boc-Phe-Ser-Arg-MCA检测小鼠血浆中2种牙龈素的活性。将40只C57BL/6N小鼠随机分为4组,分别为对照组、牙龈素组、牙龈素+Kgp抑制剂(COR388)组和COR388组。预先给予COR388处理1 h后,再腹腔注射牙龈素提取物,24 h后麻醉下取材,脑组织经固定、脱水、包埋、切片等步骤后,分别使用离子钙适配分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)抗体和神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体标记小鼠大脑皮层小胶质细胞和星形胶质细胞,采用免疫组织化学技术观察上述4组小鼠大脑皮层小胶质细胞及星形胶质细胞的激活情况。采用酶联免疫吸附测定检测大脑皮层肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达水平。结果·蛋白质印迹分析显示,该牙龈素提取物在截留分子量50000和70000附近有较清晰的条带,表明该提取物具有牙龈素免疫原性。此牙龈素提取物具有生物活性,腹腔注射牙龈素提取物后,小鼠血浆牙龈素活性呈现先升后降的趋势。腹腔注射牙龈素提取物后4~8 h,小鼠血浆牙龈素活性达到峰值,随后逐渐下降。免疫组织化学结果显示,小鼠大脑皮层的小胶质细胞和星形胶质细胞体积增大,且具有不规则突起,提示腹腔注射牙龈素提取物可激活小鼠脑内小胶质细胞和星形胶质细胞。酶联免疫吸附测定结果表明小鼠大脑皮层炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平升高。结论·急性感染牙龈素提取物可促进小鼠脑神经炎症。