L-赖氨酸脱羧酶的表达、纯化及其酶学性质研究

戊二胺可由赖氨酸经过赖氨酸脱羧酶脱羧生成,是生物基聚酰胺PA56的关键单体。该研究以pET-28a(+)质粒为载体,将来源于大肠杆菌K12 MG1655的赖氨酸脱羧酶Ldc基因,经过密码子优化后克隆到大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-Ldc,用Ni-Agarose柱分离纯化出带有His标签的目的蛋白,进行酶学性质研究。重组酶Ldc分子质量在81.2 kDa左右,比酶活力为0.56 U/mg,在pH 5.7~8.0稳定性较好,相对酶活力保持80%上;该酶在20~60℃稳定性很好,T_(50)值为72℃;金属离子对酶活力有一定的影响,在终浓度为5 mmol/L条件下,Cu^(2+)抑制作用最明显,其次是Ni^(2+),而Mg^(2+)和Ca^(2+)有微弱的激活作用;对赖氨酸脱羧酶的动力学参数进行了表征,该酶对赖氨酸具有较好的亲和力和催化效率,其K_(m)为0.011 mol/L,V_(max)值为0.643 mmol/(L·min),k_(cat)值为0.23 s-1。研究结果为赖氨酸脱羧酶Ldc分子改造和工业化生产应用提供了科学依据。

黄瓜发芽期耐冷性与赖氨酸脱羧酶基因表达

经15℃低温诱导,采用cDNA-AFLP技术从耐冷性强的黄瓜品种长春密刺中分离到一条特异片段,该片段在耐冷性弱的北京截头中不能被诱导,命名为cctr132。将cctr132回收测序并翻译为氨基酸序列,用blastx和blsatp程序在NCBIGenBank数据库中进行同源性检索和相似性比对,结果发现cctr132与水稻推测的类赖氨酸脱羧酶蛋白同源性为88.37%,相似性为100%,并且在CCTR132中检测到了赖氨酸脱羧酶家族推测的保守结构域PGGXGTXXE,说明黄瓜发芽期耐冷性与赖氨酸脱羧酶基因表达有关。

赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质

考察了蜂房哈夫尼菌(H.alveiAS1.1009)的L-赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的脱羧作用,分析了培养基、温度、pH、激活剂等因素对酶活力的影响。实验结果表明,最适培养基成分为:ρ(蔗糖)=20 g/L、ρ(玉米浆)=20g/L、ρ(酵母膏)=5 g/L、ρ(牛肉膏)=3 g/L、ρ(蛋白胨)=10 g/L、ρ(氯化钠)=5 g/L、ρ(硫酸铵)=2 g/L、ρ(维生素B6)=5 g/L和ρ(L-赖氨酸)=5 g/L,100 mL发酵液中接种量为5 mL液体菌种。最佳转化工艺条件为:转化体系温度35℃、pH=5.0,ρ(菌体)=10 g/L,ρ(吐温-80)=0.15 g/L。L-赖氨酸脱羧酶在最适发酵和转化条件下比酶活可达7 984.43 U,底物转化率可达70%。

用固定化L-赖氨酸脱羧酶细胞制备1,5-戊二胺

研究了4种固定化蜂房哈夫尼菌(H.alveiAS1.1009)菌体细胞的材料和方法,包括海藻酸钙包埋法、半透膜透析袋法、海藻酸钙-明胶交联包埋法和明胶包埋法。其中海藻酸钙包埋法稳定性最好,该方法最优转化条件为:在ρ(海藻酸钠)=30g/L的水溶液中,最适菌体质量浓度为ρ(菌体)=30.8g/L,100mL转化液中海藻酸钙球体体积为30mL,转化最适温度为37℃,最适pH=5.0。用该方法转化测得比酶活可达1028.9U。重复性佳:第一批固定化细胞酶活可达游离菌体的98.62%,第四批可达第一批酶活的38.68%。

苦豆子赖氨酸脱羧酶基因克隆与表达分析

赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC)基因是苦豆子中氧化苦参碱(oxymatrine,OMA)生物合成的第一个关键酶基因。根据近缘物种苦参的赖氨酸脱羧酶基因设计特异引物,同源克隆法克隆了苦豆子赖氨酸脱羧酶基因的蛋白质编码区序列,全长1368bp,命名为Sa-LDC,GenBank登录号为KM249871。生物信息学分析表明SaLDC编码区序列无内含子,与苦参和狗苦参的LDC序列一致性均达到97%;属于Ⅲ型5-磷酸吡哆醛依赖酶[typeⅢpyridoxal 5-phosphate(PLP)-dependent enzymes,PLPDE-Ⅲ]超基因家族,功能活跃。Sa-LDC编码455个氨基酸残基,其编码的肽链相对分子质量49.14kD,理论等电点5.63,无信号肽和跨膜结构;在其氨基酸序列中具有产喹诺里西啶生物碱的特征性保守位点Phe^(340);系统进化树将苦豆子与其他产喹诺里西啶类生物碱的植物聚为一类。qPCR和HPLC检测显示,苦豆子赖氨酸脱羧酶基因的表达和氧化苦参碱的积累均受干旱胁迫的影响,且基因的表达量与氧化苦参碱的积累呈正相关关系。

L-赖氨酸脱羧酶活力测定方法的研究

以蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)为基础,进行L-赖氨酸脱羧酶活力的研究。对酶活测定过程中影响酶活力的三个主要因素:生物量,转化时间和初始底物浓度进行了选择和优化。最终确定了一种较为简便的L-赖氨酸脱羧酶活力的测定方法,即:调整发酵液的初始OD620=6(稀释10倍),补加200 g/L的L-赖氨酸母液至20 g/L,35℃静置转化3 h,测定L-赖氨酸的消耗量。酶活定义为:在35℃下,在1 min内能转化1μg L-赖氨酸的酶量为1个活力单位。本方法操作简单,无污染,且检测结果准确可靠(r=0.9901),稳定性良好(RSD=5.07%)。

枯草芽孢杆菌BJ3-2赖氨酸脱羧酶基因yaaO的克隆与序列分析

根据Gen Bank中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株假定的赖氨酸脱羧酶基因(LDC)序列设计同源引物,提取枯草芽孢杆菌BJ3-2基因组DNA进行PCR扩增,并克隆至p GEM-T载体后测序。序列分析结果表明:Bacillus subtilis BJ3-2 yaa O基因开放阅读框(ORF)长为1 443 bp,获得基因登录号为KJ561349,BLAST比对与已报道枯草芽孢杆菌的yaa O基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性均高达90%以上,对赖氨酸脱羧酶氨基酸序列构建系统进化树分析,发现Bacillus subtilis BJ3-2的LDC与B.subtilis JS亲缘关系最近,SWISS-MODEL预测该蛋白的3D结构与鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶蛋白相似性为39.22%,属于典型的III型磷酸吡哆醛(PLP)依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族成员。yaa O基因序列分析及氨基酸保守结构域的分析,为有效控制水豆豉产品中尸胺含量过高的研究提供了理论基础。

响应面法优化赖氨酸脱羧酶产酶培养基

目的:对蜂房哈夫尼菌产L-赖氨酸脱羧酶培养基进行优化。方法:采用响应面优化的方法。首先单因素实验得到最适培养基成分为:葡萄糖2%,酵母膏2%,MgSO40.03%,KH2PO40.01%,NaCl 0.3%,L-赖氨酸0.5%,维生素B60.1%,玉米浆4%,酶活达到180.85U/mL。在此基础上,用PB试验筛选出对酶活影响显著的3个因素(葡萄糖、酵母膏、玉米浆),再通过Box-behnken实验对这三个因素进行优化。结果:得到产酶最佳培养基为葡萄糖1.84%,酵母膏2.20%,玉米浆3.66%,MgSO40.03%,K2HPO40.01%,NaCl 0.3%,L-赖氨酸0.5%,维生素B60.1%。结论:响应面优化的方法使酶活达到203.14U/mL,比优化前的比酶活(7.03U/mL)提高28.9倍,在单因素的基础上提高了11.3%。

通过DNA改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc

利用DNA改组技术对赖氨酸脱羧酶野生型基因ldc进行随机突变,在大肠杆菌Escherichia coli JM109中构建赖氨酸脱羧酶突变体库。从E.coli JM109和蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009中分别克隆出赖氨酸脱羧酶基因cad A和ldc。查询NCBI数据库得知,二者的同源性为75%。分别构建重组质粒p Trc99a-cad A和p Trc99a-ldc,以此2种质粒为模板,经PCR扩增,获得目的基因片段,分析目的基因片段中存在的限制性酶切位点,用多种限制性内切酶碎片化2种基因,切割成不同大小的片段。这些小片段进行不同组合,突变体经过LBXL平板初筛和高效液相色谱(HPLC)复筛,获得1株酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体,编号为LDC2-16,其比酶活为4 869.86 U/mg(以1 mg总蛋白计),与2种野生型赖氨酸脱羧酶基因表达的酶Cad A(1 652.63 U/mg)、Ldc(2 365.93 U/mg)相比,在最适温度37℃、p H 6.0时,突变体的比酶活分别是上述野生型酶的2.95和2.06倍。摇瓶发酵5 h后,目标产物1,5-戊二胺产量从46.9提高至63.9 g/L,提高了36%。

诱导蜂房哈夫尼菌产L-赖氨酸脱羧酶条件的研究

用响应面法对蜂房哈夫尼茵(Hafina alvei)L-赖氨酸脱羧酶产酶诱导条件进行优化。首先通过单因素实验对产酶体系的pH、震荡培养时间、静置培养时间、诱导物添加量和VB6添加量进行优化。在此基础上,用部分因子重复试验筛选出对酶活影响显著的3个因素(静置培养时间,诱导物添加量,VB6添加量),再通过Box-behnken实验对这三个因素进行优化,得出最优值。最终得到产酶最佳诱导条件为:震荡培养阶段培养基pH6.5,静置培养阶段pH5.5;摇床震荡培养11h后静置培养7.5h,诱导物L-赖氨酸加入量为5.18g/L,维生素B6加入量为1.38g/L时酶活最高,达到71.2U/mL,为优化前(1.74U/mL)的41.8倍,在单因素的基础上提高了19%。

赖氨酸脱羧酶试验筛检侵袭性大肠杆菌的应用研究

观察、比较了１３００株大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶试验、动力、产气以及ＥＩＥＣ血清凝集和豚鼠角膜之间的关系，发现有９６．８％分离的大肠杆菌为赖氨酸脱羧酶试验阳性，无侵袭力，只有赖氨酸脱羧酶试验阴性、无动力的菌株才可产生角膜炎。从而使９６．８％的受检大肠杆菌免作血清学和动物试验。因此，作者认为赖氨酸脱羧酶试验、动力和产气三项试验可作为检测ＥＩＥＣ的初筛试验。

赖氨酸脱羧酶分子改造及其催化合成戊二胺

1,5-戊二胺(戊二胺)具有良好的生物活性,广泛应用在农业、医药以及工业等领域。赖氨酸脱羧酶可以催化L-赖氨酸生产戊二胺,为了提高赖氨酸脱羧酶催化合成戊二胺的效率,首先在大肠杆菌中克隆表达了粘质沙雷氏菌来源的赖氨酸脱羧酶(SmcadA)。生化特征表明,SmcadA最适催化pH为6.0,最适催化温度约为40℃。随后对SmcadA的第348位氨基酸进行了突变研究,筛选获得了催化效率显著提高的突变体Gly348Ala,主要原因是该突变导致蛋白中氨基酸残基和底物之间相互作用的氢键数增加,从而影响其催化效率。最后,对重组菌株细胞进行了戊二胺合成研究,催化反应25 h,含有突变体Gly348Ala的重组菌细胞可以催化合成218.2 g/L戊二胺,野生型SmcadA重组菌仅能催化合成159.2 g/L戊二胺。该研究结果为工业化酶催化合成戊二胺提供了借鉴。

基于盐胁迫的苦豆子种子生理特性和赖氨酸脱羧酶基因表达分析

【目的】本文研究了盐胁迫下苦豆子萌发种子的生理特性和赖氨酸脱羧酶基因SaLDC表达量的变化。【方法】用NaCl溶液胁迫苦豆子种子,统计盐胁迫后种子的各项活力指标,测定子叶的PMP、MDA和Pro含量以及SOD、POD、CAT抗氧化酶活性。qPCR测定SaLDC表达量,HPLC测定Cad含量。【结果】随着NaCl溶液浓度的增加,种子的各项活力指标降低,相对盐害率上升。苦豆子能耐受NaCl溶液胁迫,保持种子正常萌发率达到50%的阈值为200 mmol·L-1。轻度盐胁迫(NaCl溶液≤100 mmol·L-1)时,POD酶起主要保护作用,在重度盐胁迫(NaCl溶液>200 mmol·L-1)下,CAT酶起主要保护作用;SaLDC在子叶中表达量最高,下胚轴中表达量最低,盐胁迫促使该基因表达上调;子叶中未检测到Cad,但在下胚轴和胚根中随NaCl溶液浓度的增加Cad含量降低。【结论】盐胁迫影响苦豆子种子的萌发和相关耐盐生理特性,SaLDC对盐胁迫的应答存在组织特异性。

苦豆子赖氨酸脱羧酶基因启动子在拟南芥中的表达分析

赖氨酸脱羧酶(LDC)基因是苦豆子中氧化苦参碱(OMA)生物合成的第一个关键酶基因。在已有苦豆子赖氨酸脱羧酶基因(SaLDC)基础上克隆得到该基因上游1260 bp的启动子序列,GenBank登录号为KY038928,前期在苦豆子愈伤组织中的瞬时表达研究显示该启动子具有启动活性。生物信息学分析发现该启动子区域除了拥有启动子区的基本顺式作用元件TATA-box和CAAT-box外,还具有多个与光信号、逆境应答等相关的顺式作用元件。为进一步研究SaLDC启动子的功能,构建了该启动子与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因融合的植物表达载体并通过农杆菌介导遗传转化拟南芥,同时对光诱导和聚乙二醇(PEG)胁迫的转基因拟南芥进行GUS活性染色和定量分析。结果显示,在T2代转基因拟南芥幼苗的不同生长阶段和成株的各组织器官中均可检测到GUS酶活性,且随幼苗生长时间的延长,叶片中的表达活性下降;在成株叶片和花萼中的表达活性强于根、茎、花瓣和角果。光和PEG胁迫均能诱导转基因拟南芥中GUS的表达;GUS酶活性定量测定显示,短时间的PEG胁迫(1~2 h)GUS酶活性显著上调(P<0.05),而连续胁迫8 h时GUS酶活性下调至最低(P<0.01),比胁迫前下降了28.2%。以上结果表明SaLDC启动子既有时空表达特异性又有组织表达特异性,光诱导和干旱胁迫对结构基因的表达有重要的调控作用。

赖氨酸脱羧酶快速试验在沙门氏菌健康带菌检查中的应用

赖氨酸脱羧酶快速试验在沙门氏菌健康带菌检查中的应用常熟市卫生防疫站郑效玉，朱均，吴国强，吴建中，王俭沙门氏菌健康带菌检查中，赖氨酸脱羧酶试验（以下简称ＬＬＡ）应用较多。为寻找比现行微量管法更快速、简便的方法，作者建立了ＬＬＡ快速试验，及ＷＳ－ＬＬＡ沙...

赖氨酸脱羧酶单管试验在诊断EIEC中的效用

从Falkow法(常规法)抽去基础培养基蛋白胨,代以氯化钠称单管法。56株EIEC血清型大肠菌用单管法和常规法对比赖氨酸脱羧酶试验(赖酶试验)。并以140-Md质粒(140-Md)检测和豚鼠角膜结膜炎试验(Sereny试验)分析三者关系。结果发现:凡140-Md(+)菌株,单管法赖酶试验均(-)。25株140-Md(-)株,两法均在24小时内脱羧。但常规法中8株140-Md(+)株3～4天内脱羧,其中5株Sereny试验(+)。作者根据EIEC血清型大肠菌140-Md(+)与单管法赖酶试验(-)一致性的结果,对少数140-Md(+)而Sereny试验(-)株应纳入EIEC范畴进行了诊断依据的讨论。

L-赖氨酸脱羧酶酶电极的研制

将赖氨酸脱羧酶直接固定于CO_2电极的硅橡胶气透膜上制成的赖氨酸脱羧酶酶电极,性能如下:(1)酶电极对赖氨酸的线性响应浓度范围为0.0025—0.1％;极羞为50—55mV;CV值小于5％;(2)连续使用寿命超过30天;(3)高度专一;(4)用于测定发酵过程赖氨酸浓度变化,结果与瓦氏呼吸仪的数据平行,相关性良好。

蛇足石杉赖氨酸脱羧酶基因的克隆、原核表达及其功能分析

赖氨酸脱羧酶(Lysine decarboxylase,LDC)是抗老年痴呆药——石杉碱甲生物合成的第一个酶。为了研究蛇足石杉中LDC的特性和功能,以其总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到2个赖氨酸脱羧酶基因LDC1和LDC2,克隆至pMD?19-T中测序发现,两基因同源性为95.3%,分别编码212和202个氨基酸。将两基因引入pET-32a(+)构建重组表达质粒pET-32a(+)/LDC1和pET-32a(+)/LDC2,分别转入BL21(ED3)中进行诱导表达,在30℃条件下获得可溶性表达产物Trx-LDC1和Trx-LDC2;采用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,建立酶促反应体系分析其脱羧酶活性,薄层层析(TLC)检测表明重组融合蛋白Trx-LDC1和Trx-LDC2均能催化赖氨酸脱羧生成尸胺。利用生物信息学软件分析发现LDC1和LDC2理化性质存在差异,但预测的二级结构和三维结构基本一致。

苦豆子赖氨酸脱羧酶基因表达与苦参碱和氧化苦参碱含量的关系

目的研究干旱胁迫下苦豆子子叶中赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC)基因表达量与苦参碱(matrine,MA)和氧化苦参碱(oxymatrine,OMA)含量的关系。方法以不同质量分数PEG 6000胁迫萌动苦豆子种子,72 h后高效液相色谱(HPLC)测定其苦参碱和氧化苦参碱含量,荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,q PCR)测定赖氨酸脱羧酶表达量。结果萌动苦豆子种子在轻度胁迫(PEG质量分数<15%)下,子叶中苦参碱和氧化苦参碱含量降低,重度胁迫(PEG质量分数>20%)下,子叶中苦参碱和氧化苦参碱含量升高。荧光定量PCR显示,子叶中赖氨酸脱羧酶表达量随胁迫加剧呈先降后升的趋势,特别是在轻度和重度胁迫下,赖氨酸脱羧酶表达量与苦参碱和氧化苦参碱含量变化一致。结论苦豆子子叶中苦参碱和氧化苦参碱含量与赖氨酸脱羧酶的表达有一定的关系。