通过DNA改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc

利用DNA改组技术对赖氨酸脱羧酶野生型基因ldc进行随机突变,在大肠杆菌Escherichia coli JM109中构建赖氨酸脱羧酶突变体库。从E.coli JM109和蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei AS1.1009中分别克隆出赖氨酸脱羧酶基因cad A和ldc。查询NCBI数据库得知,二者的同源性为75%。分别构建重组质粒p Trc99a-cad A和p Trc99a-ldc,以此2种质粒为模板,经PCR扩增,获得目的基因片段,分析目的基因片段中存在的限制性酶切位点,用多种限制性内切酶碎片化2种基因,切割成不同大小的片段。这些小片段进行不同组合,突变体经过LBXL平板初筛和高效液相色谱(HPLC)复筛,获得1株酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体,编号为LDC2-16,其比酶活为4 869.86 U/mg(以1 mg总蛋白计),与2种野生型赖氨酸脱羧酶基因表达的酶Cad A(1 652.63 U/mg)、Ldc(2 365.93 U/mg)相比,在最适温度37℃、p H 6.0时,突变体的比酶活分别是上述野生型酶的2.95和2.06倍。摇瓶发酵5 h后,目标产物1,5-戊二胺产量从46.9提高至63.9 g/L,提高了36%。

黄瓜发芽期耐冷性与赖氨酸脱羧酶基因表达

经15℃低温诱导,采用cDNA-AFLP技术从耐冷性强的黄瓜品种长春密刺中分离到一条特异片段,该片段在耐冷性弱的北京截头中不能被诱导,命名为cctr132。将cctr132回收测序并翻译为氨基酸序列,用blastx和blsatp程序在NCBIGenBank数据库中进行同源性检索和相似性比对,结果发现cctr132与水稻推测的类赖氨酸脱羧酶蛋白同源性为88.37%,相似性为100%,并且在CCTR132中检测到了赖氨酸脱羧酶家族推测的保守结构域PGGXGTXXE,说明黄瓜发芽期耐冷性与赖氨酸脱羧酶基因表达有关。

苦豆子赖氨酸脱羧酶基因克隆与表达分析

赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC)基因是苦豆子中氧化苦参碱(oxymatrine,OMA)生物合成的第一个关键酶基因。根据近缘物种苦参的赖氨酸脱羧酶基因设计特异引物,同源克隆法克隆了苦豆子赖氨酸脱羧酶基因的蛋白质编码区序列,全长1368bp,命名为Sa-LDC,GenBank登录号为KM249871。生物信息学分析表明SaLDC编码区序列无内含子,与苦参和狗苦参的LDC序列一致性均达到97%;属于Ⅲ型5-磷酸吡哆醛依赖酶[typeⅢpyridoxal 5-phosphate(PLP)-dependent enzymes,PLPDE-Ⅲ]超基因家族,功能活跃。Sa-LDC编码455个氨基酸残基,其编码的肽链相对分子质量49.14kD,理论等电点5.63,无信号肽和跨膜结构;在其氨基酸序列中具有产喹诺里西啶生物碱的特征性保守位点Phe^(340);系统进化树将苦豆子与其他产喹诺里西啶类生物碱的植物聚为一类。qPCR和HPLC检测显示,苦豆子赖氨酸脱羧酶基因的表达和氧化苦参碱的积累均受干旱胁迫的影响,且基因的表达量与氧化苦参碱的积累呈正相关关系。

枯草芽孢杆菌BJ3-2赖氨酸脱羧酶基因yaaO的克隆与序列分析

根据Gen Bank中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株假定的赖氨酸脱羧酶基因(LDC)序列设计同源引物,提取枯草芽孢杆菌BJ3-2基因组DNA进行PCR扩增,并克隆至p GEM-T载体后测序。序列分析结果表明:Bacillus subtilis BJ3-2 yaa O基因开放阅读框(ORF)长为1 443 bp,获得基因登录号为KJ561349,BLAST比对与已报道枯草芽孢杆菌的yaa O基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性均高达90%以上,对赖氨酸脱羧酶氨基酸序列构建系统进化树分析,发现Bacillus subtilis BJ3-2的LDC与B.subtilis JS亲缘关系最近,SWISS-MODEL预测该蛋白的3D结构与鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶蛋白相似性为39.22%,属于典型的III型磷酸吡哆醛(PLP)依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族成员。yaa O基因序列分析及氨基酸保守结构域的分析,为有效控制水豆豉产品中尸胺含量过高的研究提供了理论基础。

基于盐胁迫的苦豆子种子生理特性和赖氨酸脱羧酶基因表达分析

【目的】本文研究了盐胁迫下苦豆子萌发种子的生理特性和赖氨酸脱羧酶基因SaLDC表达量的变化。【方法】用NaCl溶液胁迫苦豆子种子,统计盐胁迫后种子的各项活力指标,测定子叶的PMP、MDA和Pro含量以及SOD、POD、CAT抗氧化酶活性。qPCR测定SaLDC表达量,HPLC测定Cad含量。【结果】随着NaCl溶液浓度的增加,种子的各项活力指标降低,相对盐害率上升。苦豆子能耐受NaCl溶液胁迫,保持种子正常萌发率达到50%的阈值为200 mmol·L-1。轻度盐胁迫(NaCl溶液≤100 mmol·L-1)时,POD酶起主要保护作用,在重度盐胁迫(NaCl溶液>200 mmol·L-1)下,CAT酶起主要保护作用;SaLDC在子叶中表达量最高,下胚轴中表达量最低,盐胁迫促使该基因表达上调;子叶中未检测到Cad,但在下胚轴和胚根中随NaCl溶液浓度的增加Cad含量降低。【结论】盐胁迫影响苦豆子种子的萌发和相关耐盐生理特性,SaLDC对盐胁迫的应答存在组织特异性。

苦豆子赖氨酸脱羧酶基因启动子在拟南芥中的表达分析

赖氨酸脱羧酶(LDC)基因是苦豆子中氧化苦参碱(OMA)生物合成的第一个关键酶基因。在已有苦豆子赖氨酸脱羧酶基因(SaLDC)基础上克隆得到该基因上游1260 bp的启动子序列,GenBank登录号为KY038928,前期在苦豆子愈伤组织中的瞬时表达研究显示该启动子具有启动活性。生物信息学分析发现该启动子区域除了拥有启动子区的基本顺式作用元件TATA-box和CAAT-box外,还具有多个与光信号、逆境应答等相关的顺式作用元件。为进一步研究SaLDC启动子的功能,构建了该启动子与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因融合的植物表达载体并通过农杆菌介导遗传转化拟南芥,同时对光诱导和聚乙二醇(PEG)胁迫的转基因拟南芥进行GUS活性染色和定量分析。结果显示,在T2代转基因拟南芥幼苗的不同生长阶段和成株的各组织器官中均可检测到GUS酶活性,且随幼苗生长时间的延长,叶片中的表达活性下降;在成株叶片和花萼中的表达活性强于根、茎、花瓣和角果。光和PEG胁迫均能诱导转基因拟南芥中GUS的表达;GUS酶活性定量测定显示,短时间的PEG胁迫(1~2 h)GUS酶活性显著上调(P<0.05),而连续胁迫8 h时GUS酶活性下调至最低(P<0.01),比胁迫前下降了28.2%。以上结果表明SaLDC启动子既有时空表达特异性又有组织表达特异性,光诱导和干旱胁迫对结构基因的表达有重要的调控作用。

赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质

考察了蜂房哈夫尼菌(H.alveiAS1.1009)的L-赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的脱羧作用,分析了培养基、温度、pH、激活剂等因素对酶活力的影响。实验结果表明,最适培养基成分为:ρ(蔗糖)=20 g/L、ρ(玉米浆)=20g/L、ρ(酵母膏)=5 g/L、ρ(牛肉膏)=3 g/L、ρ(蛋白胨)=10 g/L、ρ(氯化钠)=5 g/L、ρ(硫酸铵)=2 g/L、ρ(维生素B6)=5 g/L和ρ(L-赖氨酸)=5 g/L,100 mL发酵液中接种量为5 mL液体菌种。最佳转化工艺条件为:转化体系温度35℃、pH=5.0,ρ(菌体)=10 g/L,ρ(吐温-80)=0.15 g/L。L-赖氨酸脱羧酶在最适发酵和转化条件下比酶活可达7 984.43 U,底物转化率可达70%。

番茄S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SlSAMDC1的克隆与序列分析

以蔓陀罗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶全长cDNA序列为信息探针,筛选NCBI番茄EST数据库,依据同源EST信息,经人工拼接、RT-PCR及RACE技术验证,获得了1个新的SAMDC基因家族成员,命名为SlSAMDC1(GenBank登录号:EF550528),并利用染色体步移技术克隆了879bp的上游调控区域。SlSAMDC1cDNA序列全长1847bp,5′-UTR和3′-UTR分别长523和241bp;存在3个ORF(微型uORF、小型uORF和主ORF),主ORF编码360个氨基酸的SAMDC酶原;SlSAMDC1基因组序列全长3648bp,有3个内含子,均位于5′-UTR,所有内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则。SlSAMDC1基因与其它植物来源SAMDC基因同源性较高,与人、大肠杆菌以及酵母的同源性较低。表达谱分析发现,SlSAM-DC1基因在番茄根、茎、叶、花蕾、果实等器官中均表达,果实中的表达量相对较高。生物信息学分析表明,SlSMDC1基因的上游调控序列存在多个顺式作用元件,如W-box、TATA-box、CAAT-box等。

棉花精氨酸脱羧酶基因GhADC1克隆与表达分析

以抑制性消减杂交(SSH)文库序列为基础,采用生物信息学和RT-PCR方法从陆地棉中克隆出精氨酸脱羧酶基因,命名为GhADC1,GenBank登录号为KC851856。该基因全长2954 bp,其中5'非翻译区477 bp,具有多个参与胁迫响应的顺式作用元件和一个编码8个氨基酸的微型编码序列(uORF);主编码区(mORF)2181 bp,共编码726个氨基酸,其中N端具有叶绿体定位信号肽。推测的GhADC1蛋白具有PLP结合位点及Orn/Dap/Arg脱羧酶的信号位点,属于典型的III型PLP依赖型精氨酸脱羧酶家族成员。荧光定量RT-PCR结果表明,正常条件下,GhADC1在叶片中表达量高于茎和根部组织,且在抗黄萎病品种冀棉20中的表达水平高于耐病品种中521;黄萎病菌胁迫能够快速诱导抗病品种根部GhADC1表达,而在耐病品种中未见明显差异,推测在抗病品种中GhADC1可能参与根部对黄萎病菌胁迫的早期应答。

用固定化L-赖氨酸脱羧酶细胞制备1,5-戊二胺

研究了4种固定化蜂房哈夫尼菌(H.alveiAS1.1009)菌体细胞的材料和方法,包括海藻酸钙包埋法、半透膜透析袋法、海藻酸钙-明胶交联包埋法和明胶包埋法。其中海藻酸钙包埋法稳定性最好,该方法最优转化条件为:在ρ(海藻酸钠)=30g/L的水溶液中,最适菌体质量浓度为ρ(菌体)=30.8g/L,100mL转化液中海藻酸钙球体体积为30mL,转化最适温度为37℃,最适pH=5.0。用该方法转化测得比酶活可达1028.9U。重复性佳:第一批固定化细胞酶活可达游离菌体的98.62%,第四批可达第一批酶活的38.68%。

棉花S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因(GhSAMDC2/3/4)的克隆及其诱导表达分析

利用电子克隆结合RT-PCR技术克隆获得陆地棉(Gossypium hirsutum L.)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因家族3个基因,分别命名为Gh SAMDC2、Gh SAMDC3和GhSAMDC4。序列分析显示,该基因c DNA包含的upstream ORF(u ORF)和main ORF(m ORF)为植物SAMDC基因特征ORF,其中m ORF长度分别为1068 bp、1110 bp和1032 bp,分别编码355、369和343个氨基酸。聚类分析表明,Gh SAMDC2/3蛋白与可可树(Theobroma cacao)SAMDC聚为一类,且Gh SAMDC2与GhSAMDC3蛋白亲缘关系最近;Gh SAMDC4与拟南芥At SAMDC4聚为一类。实时荧光定量PCR分析表明,Gh SAMDC2在茎中表达相对较高,随着纤维发育其表达量不断增加,在纤维发育后期其表达量达到最高;Gh SAMDC2/3/4在不同的胁迫条件下表现出不同的表达模式,Gh SAMDC2受低温和干旱胁迫诱导最强烈,Gh SAMDC3响应盐胁迫显著,Gh SAMDC4受ABA诱导强烈。上述结果为进一步研究棉花SAMDC基因功能奠定了一定基础。

枯草芽孢杆菌BJ3-2精氨酸脱羧酶基因speA的克隆与序列分析

根据GenBank中枯草芽孢杆菌168菌株的精氨酸脱羧酶基因speA序列设计特异性引物,提取Bacillus subtilis BJ3-2基因组DNA进行PCR扩增,并克隆至pGEM-T载体后测序。序列分析结果表明,Bacillus subtilis BJ3-2 speA基因ORF长为1 473 bp,可编码490个氨基酸,分子质量为53.53ku,基因登录号为KJ561348,与已报道枯草芽孢杆菌的speA基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达93%以上,精氨酸脱羧酶氨基酸序列系统进化树分析,发现Bacillus subtilis BJ3-2的ADC与Bacillus subtilis 168亲缘关系最近,属于典型的III型PLP依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族成员。speA基因序列分析及其蛋白保守结构域的分析,为有效控制水豆豉产品中生物胺含量的研究提供了理论依据。

L-赖氨酸脱羧酶活力测定方法的研究

以蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)为基础,进行L-赖氨酸脱羧酶活力的研究。对酶活测定过程中影响酶活力的三个主要因素:生物量,转化时间和初始底物浓度进行了选择和优化。最终确定了一种较为简便的L-赖氨酸脱羧酶活力的测定方法,即:调整发酵液的初始OD620=6(稀释10倍),补加200 g/L的L-赖氨酸母液至20 g/L,35℃静置转化3 h,测定L-赖氨酸的消耗量。酶活定义为:在35℃下,在1 min内能转化1μg L-赖氨酸的酶量为1个活力单位。本方法操作简单,无污染,且检测结果准确可靠(r=0.9901),稳定性良好(RSD=5.07%)。

马兜铃酪氨酸脱羧酶基因克隆、测序及同源性分析

[目的]从中草药马兜铃中获得酪氨酸脱羧酶基因(tyrDC)互补DNA(cDNA)序列并进行同源性分析,以进一步达 到敲除tyrDC,减轻该药肾毒性的目的。[方法]参照已知的植物酪氨酸脱羧酶的保守性氨基酸序列设计简并引物,并通过 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从马兜铃中扩增出cDNA片段。将扩增的cDNA序列克隆并测序,用以设计特异引物,并 通过cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)从马兜铃中扩增出全长tyrDC cDNA。[结果]该克隆的 tyrDC cDNA的总长度为1 678 bp,包括一个编码516个氨基酸的1 551bp开读框(ORF)和一段127 bp的下游非翻译区 (3'UTR)。序列比较结果表明,由马兜铃tyrDC核苷酸序列推导的氨基酸序列分别与已发布的罂粟酪氨酸脱羧酶和唐松草酪 氨酸／多巴脱羧酶享有76％和79％的同源性。[结论]从马兜铃中扩增得到tyrDC cDNA全序列,且对酪氨酸脱羧酶的同源检 索显示,不同植物的酪氨酸脱羧酶之间都存在普遍的序列相似性。为去除马兜铃肾毒性奠定了基础。

茶树中精氨酸脱羧酶基因的cDNA克隆及序列分析

通过SMARTRACE PCR技术获得了茶树中精氨酸脱羧酶(ADC)的cDNA全长序列,并登录GenBank(登录号为JQ653274)。ADC基因cDNA全长为2 988 bp,开放阅读框(ORF)全长为2 163 bp,共编码720个氨基酸,编码的蛋白质的分子量为77.430 kDa,理论等电点为5.373,其序列中不存在卷曲螺旋结构。ADC蛋白为亲水性非分泌不稳定蛋白,不跨膜运动,无信号肽序列存在,共有41个可能的磷酸化位点,存在于叶绿体基质中,是细胞质蛋白。精氨酸脱羧酶的基因cDNA全长序列的获得,对于进一步研究精氨酸在茶树氮代谢中的作用及茶氨酸代谢途径提供基础。

响应面法优化赖氨酸脱羧酶产酶培养基

目的:对蜂房哈夫尼菌产L-赖氨酸脱羧酶培养基进行优化。方法:采用响应面优化的方法。首先单因素实验得到最适培养基成分为:葡萄糖2%,酵母膏2%,MgSO40.03%,KH2PO40.01%,NaCl 0.3%,L-赖氨酸0.5%,维生素B60.1%,玉米浆4%,酶活达到180.85U/mL。在此基础上,用PB试验筛选出对酶活影响显著的3个因素(葡萄糖、酵母膏、玉米浆),再通过Box-behnken实验对这三个因素进行优化。结果:得到产酶最佳培养基为葡萄糖1.84%,酵母膏2.20%,玉米浆3.66%,MgSO40.03%,K2HPO40.01%,NaCl 0.3%,L-赖氨酸0.5%,维生素B60.1%。结论:响应面优化的方法使酶活达到203.14U/mL,比优化前的比酶活(7.03U/mL)提高28.9倍,在单因素的基础上提高了11.3%。

中国对虾甘氨酸脱羧酶的基因克隆、表达及其与抗WSSV的关联分析

本研究采用RACE技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)甘氨酸脱羧酶基因(Fc GLDC)的全长cDNA及DNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,FcGLDC基因的cDNA全长为3481 bp,其中,ORF为2829 bp,5￠UTR长17 bp,3￠UTR长86 bp。完整的阅读框编码942个氨基酸,分子量为104.66 kDa,预测的理论等电点为6.51。FcGLDC基因DNA序列全长共4964bp,包含12个外显子和11个内含子。同源性及系统进化分析显示,FcGLDC基因与节肢动物的GLDC基因聚为一类;氨基酸序列比对发现,Fc GLDC基因的蛋白序列与节肢动物的相似度最高,与内华达白蚁(Zootermopsis nevadensis)、体虱(Pediculus humanus corporis)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)的相似度分别为71%、68%和68%。在鳃、肝胰腺和肌肉中的荧光定量PCR结果显示,FcGLDC在肌肉中的相对表达量最高,鳃中最低。WSSV感染后,该基因在鳃、肝胰腺和肌肉中呈现出了不同的时空表达特点。使用直接测序法结合质谱法,在该基因内部发现4个SNP位点,但是各位点与抗WSSV性状均不相关(P>0.05)。本研究表明,FcGLDC基因在对虾感染WSSV后的应答反应中或起一定作用。

苦瓜果实S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因McSAMDC的克隆、表达及亚细胞定位

根据已构建苦瓜果实均一化文库中获得的1个与SAMDC基因相关的EST序列,采用3′RACE技术,克隆获得1个苦瓜SAMDC基因的cDNA全长序列,命名为McSAMDC(GenBank登录号为KC632099)。生物信息分析结果表明,该cDNA全长1 900 bp,5′UTR和3′UTR分别长501、325 bp。该cDNA序列存在3个开放读码框(微型tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),其中mORF长1 077 bp,编码358个氨基酸,预测分子量为39.31 ku,含有酶原剪切位点结构域和蛋白快速降解有关的PEST二个保守结构域。二级结构分析显示,McSAMDC含有无规卷曲(45.53%)、α-螺旋(29.33%)、伸展链(19.83%)、β-转角(5.31%)。序列分析结果表明,McSAMDC与拟南芥(CAA69073.1)、琴叶拟南芥(XP 002882231.1)和雪里红(AAS45435.1)的氨基酸序列相似性分别达到69%、68%和68%。亚细胞定位结果表明,McSAMDC定位在细胞质中。荧光定量结果表明,McSAMDC在果实膨大期表达量最高,并随之迅速下降,并从成熟初期至完全成熟期该基因表达量逐渐增大。

诱导蜂房哈夫尼菌产L-赖氨酸脱羧酶条件的研究

用响应面法对蜂房哈夫尼茵(Hafina alvei)L-赖氨酸脱羧酶产酶诱导条件进行优化。首先通过单因素实验对产酶体系的pH、震荡培养时间、静置培养时间、诱导物添加量和VB6添加量进行优化。在此基础上,用部分因子重复试验筛选出对酶活影响显著的3个因素(静置培养时间,诱导物添加量,VB6添加量),再通过Box-behnken实验对这三个因素进行优化,得出最优值。最终得到产酶最佳诱导条件为:震荡培养阶段培养基pH6.5,静置培养阶段pH5.5;摇床震荡培养11h后静置培养7.5h,诱导物L-赖氨酸加入量为5.18g/L,维生素B6加入量为1.38g/L时酶活最高,达到71.2U/mL,为优化前(1.74U/mL)的41.8倍,在单因素的基础上提高了19%。

聚合酶链反应检测乳酸菌酪氨酸脱羧酶基因

酪氨酸脱羧酶与乳酸菌发酵食品中酪胺的产生密切相关。根据从GenBank中检索到的酪氨酸脱羧酶基因序列设计一对特异性引物,采用PCR技术对乳酸菌的基因组DNA片段进行扩增,以此建立以酪氨酸脱羧酶基因为靶的产酪胺乳酸菌的分子生物学检测方法。结果表明,供试12株乳酸菌中有9株菌扩增出1133bpDNA片段。对其中3株菌的扩增产物进行DNA序列测定,测序结果采用国际互联网上NCBI的BLAST工具进行同源性检索分析,发现它与已知的Enterococcusfaecalis,Enterococcusfaecium,Carnobacteriumdivergens的酪氨酸脱羧酶基因序列均高度同源,其中PLP(5'-磷酸吡哆醛)的结合位点高度保守,证明该扩增产物是酪氨酸脱羧酶的基因片段。应用该法与常规平板检测法比较显示,二者检测结果基本一致,表明本研究建立的PCR方法可作为一种快速、高度特异的检测产酪胺乳酸菌菌株的新方法。