DNA-微阵列芯片检测技术与Gene-Xpert MTB/RIF技术在新疆维吾尔自治区结核分枝杆菌耐药性诊断中的应用

目的探索DNA-微阵列芯片检测技术(以下简称基因芯片技术)和利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Gene-Xpert MTB/RIF技术)检测新疆维吾尔自治区结核分枝杆菌中利福平和异烟肼耐药性的应用价值。方法收集2015年新疆维吾尔自治区结核病耐药监测菌株115株,对所有的菌株进行比例法药敏试验、基因芯片技术、Gene-Xpert MTB/RIF技术检测。以比例法药敏试验为“金标准”,分别计算基因芯片技术与Gene-Xpert MTB/RIF技术对结核分枝杆菌耐药性诊断的效能并进行评价。结果比例法药敏试验结果显示,利福平耐药患者40例(34.78%),异烟肼耐药患者48例(41.74%)。以比例法药敏试验结果为“金标准”,基因芯片技术检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药耐药性诊断的灵敏度、特异度分别为80.00%、89.33%和77.08%、97.01%,Gene-Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性诊断的灵敏度、特异度分别为92.50%、94.67%。基因芯片技术和Gene-Xpert MTB/RIF技术对利福平耐药患者的诊断效能差异无统计学意义(P>0.05)。结论对于新疆维吾尔自治区结核病耐药监测菌株,基因芯片技术和Gene-Xpert MTB/RIF技术对耐药结核病的诊断均具有较高的灵敏度和特异度。Gene-Xpert MTB/RIF技术操作方法简单,检测时间短;基因芯片技术耐药检测范围广,耗时少,为新疆维吾尔自治区广泛开展耐药结核病快速检测提供了有力的技术支持。

高通量测定技术检测结核分枝杆菌耐利福平的研究

目的：基于焦磷酸测序(pyrosequencing)技术，建立耐利福平结核分枝杆菌快速检测方法，并探讨其临床应用价值．方法：设计一对聚合酶链反应(PCR)引物，其中一引物经生物素化修饰，PCR扩增含耐药决定区-297bp长的rpoB基因片段，借用链亲和素包被磁珠纯化单链PCR产物．设计2个正向测序引物，运用pyrosequencing技术对耐药决定区进行序列测定．通过对一系列10倍稀释的结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA进行分析，评价所建立方法的检测特异性．

高通量测定技术检测结核分枝杆菌耐利福平的研究

目的基于焦磷酸测序(pyrosequencing)技术,建立耐利福平结核分枝杆菌快速检测方法,并探讨其临床应用价值。方法设计一对聚合酶链反应(PCR)引物,其中一引物经生物素化修饰,PCR扩增含耐药决定区一297bp长的rpoB基因片段,借用链亲和素包被磁珠纯化单链PCR产物。设计2个正向测序引物,运用pyrosequencing技术对耐药决定区进行序列测定。通过对一系列10倍稀释的结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA进行分析,评价所建立方法的检测敏感性。通过对已知耐药表型的结核分枝杆菌临床分离株进行分析,评价所建立方法的检测特异性。结果PCR扩增后,可在2h内得到耐药决定区序列。所建立方法的检测灵敏度为50fgDNA/反应。在所分析的利福平敏感株中均未检测到耐药决定区突变,而在耐利福平菌株中均检测到耐药决定区突变。结论所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点,适用于对耐利福平结核分枝杆菌进行快速高通量检测。

错配PCR技术在快速检测耐药结核分枝杆菌中的应用

耐药结核病的早期快速诊断是结核病控制中亟待解决的关键问题之一。利用基因型检测耐药性包括PCR产物直接测序法，错配PCR法等。错配PCR技术最早由Newton等于1989年建立并用于人抗胰岛素基因缺陷的检查，目前已广泛应用于基因点突变的检测。根据PCR引物设计的不同，可将其分为间接错配PCR，即引物与野生型完全互补，以突变株为模板不能扩增得到PCR产物，和直接错配PCR，即引物与特定的点突变完全互补，以野生株为模板不能扩增得到PCR产物。已有用间接错配PCR方法检测结核分枝杆菌利福平耐药的报道。本研究以检测耐利福平的结核分枝杆菌rpoB基因531位点的点突变为对象，建立了直接错配PCR法，并与间接错配PCR法进行了比较。

基因芯片法联合Xpert MTB/RIF对肺结核的诊断价值

目的 探讨基因芯片法联合结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)对肺结核的诊断价值。方法 选取2019年3月至2021年2月本院收治的421例疑似肺结核患者为研究对象,采用基因芯片法、Xpert MTB/RIF及基因芯片法联合Xpert MTB/RIF处理痰标本。以痰培养结果为金标准,比较不同方法对肺结核的诊断效能;以药敏试验结果为参照,比较不同方法对利福平耐药的检出符合率。结果 基因芯片法联合Xpert MTB/RIF对肺结核的诊断灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值均高于基因芯片法、Xpert MTB/RIF,差异具有统计学意义(P<0.05)。基因芯片法联合Xpert MTB/RIF对利福平耐药的检出符合率高于基因芯片法、Xpert MTB/RIF,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 基因芯片法联合Xpert MTB/RIF对肺结核的诊断价值较高,且可判断结核分枝杆菌对利福平的耐药性。

Xpert MTB/RIF Ultra快速诊断涂阴肺结核的临床价值

目的评估超敏结核分枝杆菌和利福平耐药基因检测(XpertUltra)方案检测痰液及支气管肺泡灌洗液(BALF)标本在涂阴肺结核患者中早期、快速诊断的价值。方法选择2020年5月-2021年12月在山东省公共卫生临床中心就诊的痰涂片阴性疑似肺结核患者93例,其中临床诊断为涂阴肺结核57例,非肺结核36例。收集所有患者的痰液及BALF标本,分别采用Xpert Ultra、GeneXpert MTB/RIF(Xpert)、BACTEC MGIT 960培养(MGIT 960培养)进行检测。以临床诊断为参考标准,评价3种检测方案及相互联合检测痰液及BALF标本时诊断涂阴肺结核的敏感度、特异度及符合率。结果以临床诊断结果为参考标准,Xpert Ultra检测痰液标本对涂阴肺结核诊断的敏感度明显高于Xpert[56.14%(32/57)vs.36.84%(21/57),P=0.03]和MGIT960培养[56.14%(32/57)vs.33.33%(19/57),P=0.014];Xpert Ultra检测BALF标本对涂阴肺结核诊断的敏感度明显高于Xpert[75.44%(43/57)vs.56.14%(32/57),P=0.030]和MGIT960培养[75.44%(43/57)vs.38.60%(22/57),P<0.01]。3种检测方案及相互联合检测痰液标本诊断涂阴肺结核,受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)依次为:三者联合(0.807)>Xpert Ultra+Xpert(0.798)>Xpert Ultra+MGIT 960培养(0.789)>Xpert Ultra(0.781)>Xpert(0.684)>MGIT 960培养(0.667);检测BALF标本,AUC依次为:三者联合(0.895)=Xpert Ultra+Xpert(0.895)>XpertUltra+MGIT960培养(0.877)=XpertUltra(0.877)>Xpert(0.781)>MGIT960培养(0.693)。3种检测方案均未在入组患者中检测到利福平耐药。结论Xpert Ultra对早期、快速诊断涂阴肺结核具有较高的临床应用价值;其检测BALF的敏感度高于痰液标本,建议优先选择BALF标本。

荧光定量PCR技术检测肺外结核患者样本临床应用

目的评估赛沛分子检测技术(结核分枝杆菌和利福平耐药基因)(Gene Xpert MTB/RIF)检测心包和胸腔积液样本中结核分枝杆菌的有效性。方法收集2015年1月至2017年6月天门市第一人民人民医院和汉川市人民医院收治的286例结核病疑似患者的临床资料,分别收集158例胸腔积液和128例心包积液样品。每个样品均经过抗酸染色涂片镜检、罗氏培养基结核分枝杆菌培养(LJ培养)和Gene Xpert MTB/RIF测定。使用结核分枝杆菌罗氏培养作为金标准,评估Gene Xpert MTB/RIF技术检测MTB的有效性。结果在286例积液样本中,MTB通过LJ培养阳性者51例(17.8%),GeneXpert MTB/RIF测定阳性者43例(15%),抗酸染色镜检阳性者11例(3.8%)。Gene Xpert技术灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为84.3%、100%、100%和96.7%,抗酸染色方法的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为18.3%、99.1%、81.8%和85.4%。Gene Xpert技术检查心包积液中MTB的灵敏度可达90%。Gene Xpert MTB/RIF和抗酸染色镜检鉴定两种样本中结核分枝杆菌有效性的差异具有统计学意义(χ2=233.199、33.715、P均<0.001)。结论 GeneXpert MTB/RIF技术对于检测胸腔和心包积液中的MTB具有高灵敏度和高特异性。