赤星衣酸乙酯对A549及HepG2细胞抗癌作用及机制差异研究

目的:探讨赤星衣酸乙酯对A549细胞和HepG2细胞体外抗癌效果和作用机制的差异。方法:采用体外细胞培养实验,以MTT法检测赤星衣酸乙酯对A549细胞和HepG2细胞增殖的作用;应用流式细胞术,通过Annexin V/PI双染法检测赤星衣酸乙酯对细胞凋亡的影响,PI染色法检测赤星衣酸乙酯对细胞周期分布的影响;通过平板克隆形成实验观察赤星衣酸乙酯对克隆形成的影响;采用划痕实验观察赤星衣酸乙酯对细胞迁移的影响;应用mRNA转录组测序初步探讨赤星衣酸乙酯抗癌机制,采用RT-qPCR实验对测序结果进行验证。结果:赤星衣酸乙酯对A549细胞和HepG2细胞的增殖有抑制作用,并存在剂量、时间-效应关系;赤星衣酸乙酯可以抑制癌细胞克隆形成,促进癌细胞凋亡,抑制癌细胞迁移,并将大部分癌细胞阻滞于G_(0)/G_(1)期;通过调节BRCA2、IL-7R、F2发挥抗肺癌作用,通过调节STAT1、PAX8、PTGS2、LAMA1发挥抗肝癌作用。结论:赤星衣酸乙酯在A549细胞和HepG2细胞中可能通过调节不同基因导致两株细胞敏感性差异的存在。

烟草赤星病菌拮抗放线菌的筛选及其对病原菌的抑制作用

烟草赤星病是成熟期危害烟叶的主要病害之一,直接影响烟叶的产量和品质,造成巨大的经济损失。近十年来,随感病烟草品种的大面积种植, 施肥量(特别是施氮量)的增加,以及其它生产技术的改进等因素的影响,赤星病的发生日趋严重。分离、筛选出对赤星病菌具有良好抑制作用和防治效果的拮抗菌是实施生物防治的一项重要工作。近年来一些学者对此病害进行了生物防治研究。本课题组于2004年8-12月开展了从根际土壤中分离筛选拮抗菌的研究工作,现将结果报道如下。

烟草赤星病菌GL-6产毒条件研究初报

为确定烟草赤星病菌GL-6最佳产毒培养条件,作者就菌株的培养方式、培养液类型与产毒时期进行了研究,通过多因素试验方差分析,结果表明GL-6的最佳产毒培养条件为PD培养液静止培养或振荡培养14d.

烟草赤星病的发生及综合防治

烟草赤星病是烟草成熟时期发生的一种由交链孢菌(Alternariasp.)引起的真菌性叶斑病害,使烟叶的产量和品质大幅度下降。本文对烟草赤星病菌(Alternariaalternata)的生物学特性、病害的发生条件、症状、流行规律、影响因素及防治措施等方面作了总结阐述,为有效防治赤星病提供科学依据和措施。

抗菌肽和几丁质酶基因提高烟草对黑胫病菌和赤星病菌的抗性研究

通过农杆菌介导法将加信号肽修饰的人工合成杂合抗菌肽CEMA基因(SPCEMA),苜蓿防御素基因(AFP),苦瓜几丁质酶基因(CHI)以及SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA双价基因导入本明烟(Nicotianabenthamiana),并对转基因烟草T0和T1代进行了抗病性检测,比较了不同转基因植株的抗病效果。研究结果表明,转基因烟草对黑胫病菌(Phytoph-thoraparasiticavar.nicotianae)、赤星病菌(Alternariaalternata)的抗性均强于非转基因烟草,病情指数差异达极显著水平,其中转AFP-CHI双价基因烟草具有较强的抗性,与单价转基因烟草的抗性差异达显著水平。但各单价转基因以及双价转基因烟草之间对上述病菌并未表现出显著的抗病性差异。结果表明植物源的抗菌肽基因与几丁质酶基因在抗植物真菌病害中具有协同增效作用。

安徽烟草赤星病菌生物学特性及致病力分化研究

研究了安徽地区烟草赤星病菌的生物学特性和致病力分化,结果表明,该菌在10～35℃条件下均能生长,最适生长温度为25～30℃,温度低于7℃或高于40℃菌丝不能生长;分生孢子致死温度是53℃5min和50℃10min,幼菌丝致死温度是52℃5min和49℃10min。病菌在pH4.0～11.0的范围内均能生长,呈现双峰曲线,即在pH6.0～pH8.0生长较快,尤以pH6.0和pH8.0的条件下菌丝生长更快;分生孢子在pH4.0～11.0之间均可以萌发;在pH6.0时,产孢量最高。在光照和黑暗交替的条件下,有利于菌丝的生长和孢子产生。致病力测定结果表明,不同菌株之间致病力存在显著差异,根据接种K326烟草后所致病情指数的大小可供试菌株致病力划分为致病力强、中等、弱和不致病4种类型,说明安徽烟草赤星病菌存在明显的致病力分化;在不同烟区间和同一烟区内均存在不同致病力类型的菌株,致病力类型的分布与菌株地区来源有一定的相关。

抗烟草赤星病芽孢杆菌B102菌株的筛选及抑菌作用

从山东烟田烟草根际和根围土壤中分离到157株细菌,筛选出对烟草赤星病菌Alternaria alternata有明显抑菌作用的细菌菌株7个。其中B102菌株对烟草赤星病菌抑菌作用明显,抑菌带宽度达13.0mm。采用异步培养、对峙培养、含细菌培养等方法,测定发酵滤液及代谢产物对病原菌的作用机制。结果表明,B102菌株对病原菌的抑制作用主要依赖于其产生的抗高温的代谢产物,可抑制病菌菌丝生长、孢子萌发、菌丝细胞破裂、内含物外泄,致使病菌丧失侵染能力。B102菌株代谢产物经高温及不同的pH值条件处理后仍表现出较高的抑菌活性,表明B102菌株对外界环境条件的稳定性强。

产几丁质酶内生细菌的筛选及对烟草赤星病菌的抑制作用

从健康烟草叶片中筛选出1株产几丁质酶活性较高的内生细菌FEC-1。FEC-1菌及其代谢产物对烟草赤星病菌菌丝生长均有明显抑制作用,在PDA平板上27℃培养5 d后抑菌带宽为12.6 mm,被抑制的赤星病菌菌落边缘菌丝生长畸形、膨大呈结节状。FEC-1菌代谢产物对病菌孢子萌发呈明显的抑制作用,随代谢产物浓度提高,抑菌能力显著增强,随培养时间延长,抑菌能力降低。但试验中没有观察到菌丝细胞壁溃解、细胞质浓缩、菌丝细胞质凝聚成颗粒状并外渗等显著的几丁质酶作用病原真菌的特征。因此,该菌抑制烟草赤星病菌的机理还有待进一步研究。

烟草赤星病菌生物学特性的研究

１９９１～１９９３年从长春等地采集的标本中分离得到Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ菌株。经过对病菌的致病性、形态、生长温度、ｐＨ范围及对不同碳、氮源的利用等项目的测定，确定该病菌为Ａ．ａｌｌｅｒｎａｔａ（Ｆｒ．）Ｋｃｉｓｓｌｅｒ．是引起烟草赤星病的病原菌。病菌在５～３５℃均可生长，但以２５℃，４ｈ条件下萌发率可达１００％，病菌在９种不同的培养基上生长，其小燕麦琼胶培养基、ＰＤＡ、玉米粉琼胶培养基适合于菌丝生长，而蔗糖琼胶培养基最适合分生孢子的产生．在氮源的利用上，有机氮和无机氮均可利用。在碳源的利用上，以甘露糖、淀粉、乳糖中菌丝扩展较快，病菌在ｐＨ３．２～９．２之间均可生长，但以ｐＨ７时最合适。

重庆市烟草赤星病菌致病力测定

利用离体叶片悬滴接种法,将2005年在重庆市各烟区采集分离的烟草赤星病24个代表菌株进行了致病力测定。结果显示,所有测试菌株均具有致病力,但存在明显的致病力差异,其中强致病力菌株5个,较强菌株8个,中等致病力菌株10个,弱致病力菌株1个,分别占供试菌株的20.8%、33.3%、41.7%和4.2%。这表明试验分离获得的大多数菌株致病力居中或偏强。对来源性不同的菌株的致病力进行分析比较,发现重庆各烟区菌株的致病力有所不同,而且同一烟区的菌株致病力也存在一定的差异。离体叶片试验表明,赤星病菌不同病原菌株对烟草叶片的穿透生长能力与致病力呈明显的正相关。

烟草赤星病菌代谢产物诱导的烟草BY-2细胞ROS爆发和ATP损耗

【目的】探讨赤星病菌代谢产物(metabolic products of Alternaria alternata,MP)对烟草BY-2细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生和ATP含量的影响以及产生这种影响的原因。【方法】用10%MP处理烟草BY-2细胞,用氧电极检测不同MP处理时间后,烟草BY-2细胞呼吸速率和呼吸途径的变化,同时分析BY-2细胞内H2O2产生和ATP含量等的变化。【结果】MP处理导致了烟草BY-2细胞H2O2爆发和ATP含量下降,此外,MP处理也导致了烟草BY-2细胞总呼吸速率、细胞色素途径(cytochrome pathway)和交替氧化酶途径(AOX)的下降,并且造成线粒体通透转换孔道(permeability transition pore,PTP)开放和细胞色素c释放。【结论】MP对BY-2细胞呼吸速率和细胞色素途径的抑制不可避免地导致胞内ATP含量下降,此外MP诱导的烟草BY-2细胞氧化磷酸化的解偶联作用是MP导致胞内ATP含量下降的另一重要原因。而MP对AOX途径的抑制则是诱导胞内ROS爆发的重要原因。

蝇蛆低聚几丁糖对烟草赤星病菌的毒力测定

采用生长速率法测定了蝇蛆低聚几丁糖对烟草赤星病菌Alternaria alternata的毒力。结果表明，蝇蛆低聚几丁糖对烟草赤星病菌有一定的抑制作用，在一定浓度范围（1-16 mg/mL）内，随着浓度的提高，蝇蛆低聚几丁糖抑制率随之升高。观察发现，受抑制的菌丝均有不同程度的缩短、变粗及扭曲等症状，且产生的畸形分生孢子数随浓度的升高而增加。

烟草赤星病菌分生孢子产生条件的研究

试验研究了烟草赤星病菌分生孢子的产生条件。结果表明：葡萄糖是最好的碳源，有机氮远比无机氮好，Czapek培养基对孢子形成最适宜。病斑产孢潜能高峰在日龄27d，产孢最适温度为24℃，相对湿度在88％以下，病斑不能产孢，在90％-100％范围内，随相对湿度增加产孢量急剧增加，在连续保湿5h以下，病斑不能产孢，在7-24h范围内，时间越长，产孢量越大。

氨基酸对烟草赤星病菌毒素毒性的影响

采用摩擦接种处理法、浇根处理法和发芽种子根处理法测定了烟草赤星病菌毒素的毒性,确定了烟草发芽种子根处理法作为烟草赤星病菌毒素毒性的测定方法。用8种氨基酸分别以5种不同浓度与烟草赤星病菌GL 6毒素混合接种,测定结果表明:L 精氨酸、L 胱氨酸、L 谷氨酸、L 丙氨酸和L 天门冬氨酸所有供试浓度均增强病菌毒素毒性;而L 脯氨酸、L 色氨酸和L 缬氨酸对病菌毒素毒性有抑制作用,其有效浓度分别为0 02～0 2、0 02～0 2和0 02～2mg/mL。

中国烟草赤星病菌致病力在地理上和品种中分化状况的研究

从来自全国6大烟区11个主产烟省的烤烟和晒晾烟的14个品种上获得300多个分离物,从中鉴定出168个烟草赤星病菌;经接种测定研究了病菌致病力的组成及其地理分化和在不同品种中的发生情况。病菌致病力的地理分布有3种类型,广东、吉林2省为强致病力分布型;川、陕、鄂、皖、鲁5省为中致病力分布型;闽、豫、湘3省为弱致病力分布型。结合品种抗性测定分析提出,强致病力菌株主要发生在抗病性较强的品种中,而弱致病力菌株则主要发生在抗病性较弱的品种中。

重庆烟草赤星病菌致病力分化及培养性状研究

利用离体叶片悬滴法,将从重庆烟区采集分离的烟草赤星病菌13个代表株进行了致病力测定,在PDA平板上对其培养性状进行研究。结果表明,不同菌株之间致病力有明显的差异。其中,3株表现较强的致病力,病指为68 6、63 2和61 8;2株表现中等致病力,病指为57 0和55 6;1株表现较弱致病力,病指为22 9;5株表现弱致病力,病指为4 9、5 6、9 7、14 6和4 8;不致病的有2株,病指为0,未发现有强致病力菌株。通过不同菌株对离体叶片的穿透生长能力与致病力以及病菌来源说明,病菌对离体叶片的穿透生长能力与致病力有一定的一致趋势;在不同的烟区中存在着致病力不同的菌株,同一烟区中也存在着致病力不同的菌株。在培养性状上,13个代表菌株同以往报道的相一致,菌株致病力的强弱与其生长量和产孢量有一定的关系。

温度和叶面湿润时数对烟草赤星病菌侵染的影响

在控制条件下接种烟草赤星病菌的试验结果表明 ,在品种和菌株组成一定的情况下 ,接种温度 (DT)和叶面湿润时数 (WD)是影响病菌侵染的 2个主要因素。接种温度在 12～ 37℃范围内 ,病菌可以侵染寄主 ,成功侵染的最适温度为 2 7～ 30℃。在适宜温度条件下 ,接种后保湿 2h病菌即可侵入 ,保湿时间延长 ,侵染概率增大。侵染概率与接种温度、叶面湿润时数及其互作之间具有线性关系。

贵州典型山地气候区烟草赤星病菌的致病力

为了解贵州典型山地气候区烟草赤星病菌的致病力分化情况,利用离体叶片悬滴接种法对2011年在贵州5个典型气候区代表性植烟县采集分离的25株烟草赤星病菌进行了致病力测定。结果表明:供试病原菌均具有致病力,根据接种后的病情指数大小可将致病力分为强、较强、中、弱4种类型,不同菌株对烤烟K326叶片的致病力差异明显,其中,强致病力2株,较强致病力2株,中等致病力10株,弱致病力8株,未发现无致病力菌株,大部分菌株致病力居中;不同山地气候区烟草赤星病菌致病力存在明显差异,同一区域致病力也存在一定差异。

不同化合物对烟草赤星病菌毒素的钝化研究

为确定几种不同化合物对烟草赤星病菌产生的毒素毒性的影响 ,作者采用摩擦接种处理法、浇根处理法、种子根处理法 3种生物测定方法 ,确定了以烟草种子根处理法作为烟草赤星病菌的毒性测定方法。用 6种化合物分别以 5种不同浓度与AT毒素混合接种 ,根长测定结果表明 :氯化铁、硫酸亚铁、硫酸锰和柠檬酸在 0 .0 2 - 2 0mg/mL浓度范围内、钼酸钠在 0 .0 2 - 2mg/mL浓度范围内对对烟草赤星病菌毒素有明显钝化作用 ;所有处理中钼酸钠 0 .0 2mg/mL、柠檬酸 0 .0 2mg/mL浓度处理效果最好 ,其次为钼酸钠 0 .

烟草赤星病菌生理及农药毒力测定研究

本试验对烟草赤星病菌(Alternaria alternata)进行了生理和农药毒力测定。结果表明:该菌最适生长温度为26～28℃;最低生长温度6℃,最高生长温度37℃。分生孢子致死温度分别为50℃5分钟和49℃10分钟,幼菌丝致死温度分别为50℃10分和52℃5分钟。菌丝生长最适pH值为6～8,孢子萌发最适pH值6～7,生长和萌发最低pH值均为3。64％杀毒矾和58％瑞毒霉锰锌对该菌抑制效果最好。