赤眼鳟LGP2序列结构、组织表达及与MDA5互作特征

为探究赤眼鳟遗传学和生理学实验室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2,LGP2)的功能特征及抗草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)育种参考潜力,实验克隆获得了2940 bp的赤眼鳟lgp2(Sclgp2)全长cDNA和721 bp的5′端上游序列。Sclgp2 cDNA编码680个氨基酸,包含DEXDc(DExD/H-box helicase domain)、HELICc(helicase superfamily C-terminal domain)和CTD(C-terminal regulatory domain)结构域;其5′端上游序列含有MafB(muscle aponeurosis fibromatosis B)和IRF3(interferon regulatory factor 3)等转录因子结合位点。不同物种LGP2的功能结构域、磷酸化修饰位点数具有相似性,同时也存在结构域排布位置及序列的差异。赤眼鳟和草鱼lgp2 cDNA序列比较初步发现2个位于RNA结合功能区的GCRV抗性关联位点。系统进化分析显示,赤眼鳟LGP2先与草鱼、鲫和青鱼聚在一起,再与鲤科鱼类等聚为一大支。荧光定量表达分析显示,赤眼鳟脾脏中sclgp2表达水平显著高于其他组织,肌肉、心脏中表达量次之,而肠中表达量最低。GCRV感染后,肝脏中ifn1表达水平在24~72 h显著下降,其他组织sclgp2和ifn1表达水平未有显著变化。相关性分析结果显示,赤眼鳟肌肉sclgp2与ifn1表达水平呈极显著正相关(0.999)。酵母双杂交互作检测发现,赤眼鳟LGP2与MDA5存在弱相互作用,而其DEXDc(1~201 aa)、HELICc(390~476 aa)以及CTD(553~668 aa)结构域与MDA5无互作。该研究成功获得了sclgp2全长cDNA及5′端上游序列,明确了其序列结构、免疫表达及与MDA5的互作特征,为赤眼鳟LGP2免疫功能属性研究奠定了基础,并为草鱼抗GCRV育种提供了参考。

赤眼鳟肠道菌群结构及其潜在功能研究

为确定赤眼鳟肠道菌群结构和潜在功能,本实验采用16S rRNA测序技术分析健康的赤眼鳟肠道微生物群落结构和潜在功能。结果表明,赤眼鳟肠道菌群在门、属、种水平上的优势菌分别是放线菌门(Actinobacteri)、厚壁菌门(Firmicutes)等,绿丝菌属(Chloronema)、醋酸杆菌属(Cetobacterium)等和索氏鲸杆菌(Somerae)、邻单胞菌(Shigelloides)等;KEGG通路L1、L2、L3水平最富集的分别是新陈代谢(73.09%)、碳水化合物代谢(11.26%)和萜类和类固醇的生物合成(1.99%)。赤眼鳟肠道菌群与其他鱼类有共性也有个性,为赤眼鳟的健康养殖提供参考。

陆基圆池健康养殖赤眼鳟初步试验

赤眼鳟是一种优质经济养殖鱼类,市场价格较高。本试验显示,在气候、水质适合的地区,赤眼鳟可作为陆基圆池养殖品种,且能取得较为可观的养殖效益。试验的成功,为陆基圆池养殖模式提供了新的养殖品种选择,为充实和丰富陆基养殖模式提供了更多真实可靠的生产数据,具有较高的可借鉴及可推广价值。

赤眼鳟一年3次繁殖试验

江西上饶信江刺鲅公司从2010年引进赤眼鳟亲本进行繁殖,现每年产水花50亿尾以上,供应周边企业和农户养殖生产50克/尾左右的商品小鱼和作为鳜鱼、马口鱼、观赏鱼等肉食性鱼的饵料鱼。2021年5-7月,笔者参与了公司一年3次繁殖的生产性试验,现将结果叙述如下。

赤眼鳟人工驯养及繁育技术

赤眼鳟(Spualiobarbus Curriculus)为淡水温水性鱼类,隶属于鲤形目,鲤科,雅罗鱼亚科,赤眼鳟属.该鱼适应性强,生长较快,食性杂,饲料易解决,且其肉味鲜美,营养丰富,现已成为江河增殖放流主要对象及淡水名优养殖对象之一.韶关市渔业技术推广站自2011年起开展了赤眼鳟驯养、人工繁殖、苗种培育试验,获得成功,现总结如下.

赤眼鳟线粒体D-loop和Cyt b基因序列的对比分析

研究了长江和珠江野生赤眼鳟Squaliobarbus curriculus共4个群体24个个体的线粒体控制区(D-loop)和细胞色素b(Cyt b)基因序列,通过PCR扩增与测序,分别获得了长度为598 bp和752 bp的D-loop和Cyt b基因片段。分析表明,D-loop序列共定义了18个单倍型,存在34个简约信息位点,67个多态性位点,发生转换40次,颠换15次,插入/缺失14次。A、T、C、G平均含量分别为33.7%、35.1%、17.5%、13.7%。Cyt b序列共定义了18个单倍型,存在68个简约信息位点,72个多态性位点,发生转换60次,颠换15次,无插入/缺失位点。A、T、C、G平均含量分别为29.3%、26.4%、29.8%、14.5%。Cyt b除简约信息位点百分比大于D-loop外,多态位点百分比和单突变位点百分比均小于D-loop,说明D-loop具有较快的进化速率。D-loop序列的单倍型多样性(H)、平均核苷酸差异数(K)、核苷酸多样性(π)分别0.963 8、16.543 5和0.028 4,Cyt b的H、K和π分别为0.971 0、31.855 1和0.042 6,显示赤眼鳟具有较高的遗传多样性水平,且遗传变异主要存在于群体间。分析群体间的遗传距离和FST值,D-loop和Cyt b都一致表明:长江和珠江水系间存在明显的遗传分化,系统树和分子变异等级分析(AMOVA)也支持这一观点。同一水系群体间的遗传差异较小,Cyt b则更小;不同水系群体间的遗传差异较大,Cyt b则更大。故,Cyt b呈现出"小则越小,大则越大"的态势。分析其原因,可能与D-loop和Cyt b进化速率密切相关。

酵母多糖对赤眼鳟非特异性免疫机能的影响

分别给赤眼鳟投喂 4种不同酵母多糖含量的饲料 (w (酵母多糖 )分别为 0、 0 2 %、 0 5 %、 0 8% ) 36d。并在第 12、 2 4和 36天检测超氧化物歧化酶 (SOD)活性、溶菌酶活性、白细胞吞噬活性、红细胞的免疫功能 ,和第 36天检测血清中补体C3水平。结果表明 :饲料添加了 0 5 %和 0 8%酵母多糖的饲料能显著提高鱼类SOD酶活性、溶菌酶活性、补体C3水平、白细胞吞噬活性、红细胞的免疫功能 ,而添加了 0 2 %的酵母多糖饲料只能显著提高溶菌酶活性。

赤眼鳟(♀)与鳙(♂)杂交子代生物学特性

对赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)(♀)和鳙(Aristichthys nobilis)(♂)的杂交子一代(杂交F1)与其父母本F1一、二龄鱼的生长性能进行比较,分析了杂交F1的形态、染色体组型、倍性和红细胞大小。养殖环境分别为网箱和池塘。结果表明:该杂交组合双亲的配合力很高,连续两年试验受精率平均为59.65%,孵化率为84.93%,畸形率为4.09%,两年间分别获得鱼苗1.3万和7万尾。通过生长对照试验,杂交F1一龄鱼网箱试验生长速率比母本慢25.32%,池塘试验比母本快41.80%,二龄鱼池塘试验生长速率比父母本都慢。测定了26项形态学性状,有23项偏向母本,3项偏向父本。染色体计数和红细胞长径测定,杂交F1有二倍体和三倍体两种类型,分别是2n=48,16m+28sm+4t,NF=92和3n=72,36m+30sm+6t,NF=138。测定了88尾杂交F1红细胞长径,其中二倍体71尾,占80.68%;三倍体17尾,占19.32%。本研究旨在探讨鱼类远缘杂交的可能性和培育成养殖新品种的应用前景,并为鱼类远缘杂交理论提供基础资料。

西江广东肇庆段赤眼鳟的年龄鉴定及生长研究

于2006年5月～6月和2008年5月在珠江的干流西江广东肇庆段采用刺网捕捞赤眼鳟(Spualiobarbus cur-riculus)标本296尾。采集赤眼鳟的鳞片材料进行年轮特征观察研究,并对赤眼鳟的生长情况进行分析。结果表明,渔获中3龄、4龄赤眼鳟占优势。3龄前体长的相对增长率较大,3龄以后生长缓慢。赤眼鳟体质量生长曲线拐点为8龄,应属衰老拐点。总死亡系数Z=0.337 9,自然死亡系数M=0.193 6,捕捞死亡系数F=0.144 3,开发率为E=0.427。为确保资源的可持续利用,可允许捕捞体长应不小于230 mm,体质量不小于220 g。

珠江江段赤眼鳟早期发育形态及其补充群体状况

2007年4～11月在珠江肇庆江段进行鱼苗采样，监测该江段赤眼鳟补充群体状况，同时对人工繁殖的赤眼鳟胚胎及鱼苗进行培育、观察，并详细描述了其中13个发育期的形态特征。赤眼鳟早期发育的主要特征是：身体较短，出膜时体长约4．3mm；鳔一室期开始，腹部黑色素为一纵列，并在臀鳍形成期后逐渐消失；肌节数为11＋15＋15=41对。2007年珠江肇庆江段赤眼鳟的繁殖期主要在7～9月，其中以9月10日规模最大，单位时间采集量高达1．8×10^4尾；数据分析表明赤眼鳟的产卵繁殖对江段水文变化有明显响应。

赤眼鳟精子入卵的扫描电镜观察

选取性成熟的赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)亲鱼,体质量800~2 300 g,经人工催产后,在27℃条件下进行干法人工授精。取成熟卵及相遇后不同时间段的精卵用扫描电镜对赤眼鳟成熟精、卵及精子入卵早期过程进行观察。结果显示,赤眼鳟成熟精子为鞭毛型形态,全长19.6~22.4μm。头部直径约1.65μm,鞭毛长17.8~20.6μm,头径与鞭毛长度之比为(1∶9.89)^(1∶11.4)。赤眼鳟成熟卵呈圆形,具单一受精孔。卵膜厚度约为2.78μm,卵膜表面平滑光洁;无明显的沟或嵴,卵膜表面可见均匀分布有很多孔小管,直径约0.14μm。在动物极具一漏斗状凹陷卵膜孔,直径12.46~14.10μm,其底部为圆环状的受精孔,受精孔的周边平滑,向四周呈辐射状隆起,外孔径约5.21μm,内孔径约2.71μm。在27℃时,赤眼鳟精子18 s内可完成入卵过程;约60 s后受精孔外的精子全部解体。通过对精子、卵及精孔管的测量和扫描电镜观察,确定赤眼鳟受精方式为单精受精。

赤眼鳟生物学研究进展

赤眼鳟（Squaliobarbus curriculus）属硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科、赤眼鳟属,俗称野草鱼、红眼鱼。具有生长快、适应性强、商品鱼售价高等优点,其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富,深受消费者青睐,是江河主要优质经济鱼类之一,也是淡水养殖的热门种类。

赤眼鳟Mx基因全长cDNA克隆及其经GCRV攻毒后的组织表达分析

为研究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)Mx蛋白(Myxovirus resistance protein)的功能,采用简并PCR和SMART RACE方法从赤眼鳟脾脏中克隆得到Mx基因全长cDNA,并通过生物信息学方法分析其同源性,再利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其在脾、肝、肠、肾等9个组织中的表达,以及感染草鱼呼肠孤病毒(Reovirus of Grass carp)GCRV-104后不同时间点赤眼鳟Mx的时空表达规律。结果表明:赤眼鳟Mx基因cDNA序列(ScMx)全长2325 bp,包含5′-UTR 40 bp,3′-UTR 371 bp和ORF 1884 bp,共编码627个氨基酸,其编码的Mx蛋白分子量约为70.9 kD,理论等电点pI为8.25,具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征;赤眼鳟Mx与鲫鱼Mx3同源性最高;Mx在赤眼鳟脾、肝、肠、肾等9个组织中均有表达,其中肝脏中的相对表达量最高,脾脏次之,肠组织中的表达量最低;经GCRV-104病毒感染刺激后,ScMx在肝和脾组织中的表达量显著上调,均在48h到达峰值,分别为对照组的10倍(肝)和5倍(脾),且在这两个组织中的表达模式相似,均表现为先升高后下降的波动型变化趋势。研究表明ScMx参与了赤眼鳟抗GCRV-104病毒的免疫反应。

三个地理群体赤眼鳟遗传多样性的ISSR分析

利用ISSR分子标记技术,对丹江口水库、青龙湖(河南)和宿鸭湖3个野生赤眼鳟群体90个个体的遗传多样性进行分析。10个ISSR引物共获得96个扩增位点,其中多态位点69个,多态位点比例为71.88%。3个群体的多态位点比例分别为68.13%、64.77%和63.22%,遗传距离分别为0.1885、0.1724和0.1711,Ne i基因多样性分别为0.1509、0.1397和0.1385,Shannon信息指数分别为0.2575、0.2403和0.2372。3个群体上述指标差异均不显著(p>0.05)。丹江口水库与青龙湖群体遗传距离最远(0.1581),丹江口水库与宿鸭湖群体次之(0.1429),青龙湖和宿鸭湖群体最近(0.1344)。UPGMA聚类结果为青龙湖与宿鸭湖群体先聚在一起,其次是丹江口水库群体。结果表明:3个赤眼鳟群体的遗传多样性均较丰富,但群体间地理遗传分化差异并不明显。

赤眼鳟Toll样受体3基因cDNA全长克隆及表达分析

为探究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)Toll样受体3(Toll-like receptor 3,Sc TLR3)基因是否参与抗病毒免疫反应,实验运用RACE技术,克隆得到Sc TLR3基因c DNA全长序列,并进行了生物信息学分析;通过RealTime q PCR技术,检测了Sc TLR3 m RNA在健康赤眼鳟10个组织中的分布以及感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)后肝脏、脾脏、体肾和头肾中的表达特征。结果表明:Sc TLR3基因c DNA序列全长4043 bp,包括5?-非编码区(UTR)216 bp,开放阅读框(ORF)2715 bp和3?-UTR 1112 bp;Sc TLR3共编码904个氨基酸残基,推导的蛋白分子量102.67 k D,理论等电点8.76;SMART结构域预测显示,Sc TLR3由N端的信号肽(SP)、富亮氨酸结构域(LRRs)、跨膜结构域(TM)和C端的Toll/白介素-1受体结构域(TIR)组成。实时荧光定量结果显示,Sc TLR3m RNA在检测的各组织中均有表达,肝脏中的相对表达量极显著高于其他组织(P<0.01);感染GCRV后,肝脏、脾脏、体肾和头肾组织中Sc TLR3 m RNA均上调表达,肝脏、脾脏和体肾组织中的相对表达量在24h达到峰值,分别为对照组的5倍、7倍和6倍。研究表明,Sc TLR3具有TLRs家族基因的典型结构特征,并能被GCRV诱导表达,推测其在赤眼鳟抗GCRV入侵免疫反应中发挥了重要作用。

草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)杂交F_1与其亲本的肌肉特性比较研究

为探讨草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)杂交F_1的肉质特点,以同规格的草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)杂交F_1和其亲本草鱼(母本)、赤眼鳟(父本)为材料,采用质构仪测定分析比较了三者肌肉质构特性,采用冷冻切片法和HE染色法统计分析比较了三者肌纤维数量和密度,采用实时荧光定量PCR的方法分析了与肉质特性关联紧密的钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因、Ⅰ型胶原蛋白α1基因(COL1A1)和α2基因(COL1A2).在杂交F_1和亲本肌肉中的表达量.结果显示:杂交F_1与母本草鱼、父本赤眼鳟的肌肉黏附性、胶着性和回复性无显著性差异(P>0.05);杂交F_1的肌肉硬度、弹性、内聚性和咀嚼性均显著高于母本草鱼(P<0.05),与父本赤眼鳟无显著差异;杂交F_1的肌纤维直径和密度与其母本草鱼无显著差异(P>0.05),与其父本赤眼鳟差异显著(P<0.05);COL1A1和COL1A2两个基因在杂交F_1肌肉组织中的表达量显著高于其母本草鱼(P<0.05),而与其父本赤眼鳟无显著差异(P>0.05);CAST基因在杂交F_1肌肉组织中的表达量显著高于其母本草鱼(P<0.05),与其父本赤眼鳟无显著差异(P>0.05).

赤眼鳟鱼种配合饲料适宜钙磷水平及其比例的研究

选取平均体重为4.05 g的赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)鱼种1080尾,随机分成9组,每组3个重复,每个重复置1个1.6 m×1.2 m×1.4 m的养殖池饲养。采用3×3析因试验,研究赤眼鳟鱼种对配合饲料中钙磷的需要量及适宜钙磷比。钙和磷各分别设3个水平:0.6%、1.2%和1.8%,共配制9种试验饲料喂养45 d。结果表明:饲料中钙、磷的交互作用对赤眼鳟的特定生长率有显著影响(P<0.05),但钙、磷的交互作用对饲料系数和成活率的影响不显著(P>0.05)。饲料中钙水平对赤眼鳟的特定生长率和饲料系数无显著影响(P>0.05),但磷水平对赤眼鳟的特定生长率和饲料系数有显著影响(P<0.05)。赤眼鳟对钙、磷的需要量分别为0.6%～1.8%、1.2%～1.8%,而适合赤眼鳟生长的钙磷比为1∶1～1∶3。试验各组赤眼鳟肌肉的钙、磷含量及钙磷比以及脊椎骨的钙磷比差异均不显著(P>0.05)。但饲料中钙水平对赤眼鳟脊椎骨中钙、磷含量影响显著(P<0.05),骨中钙、磷含量均随饲料中钙水平增加而增加。

饲料蛋白质和脂肪水平对赤眼鳟生长和鱼体营养成分的影响

采用3×3因子试验设计,配制9种试验饲料,研究饲料不同蛋白质水平(31%、37%和43%)和脂肪水平(3.5%、5.5%、7.5%)对平均体重为5.49 g赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)鱼种生长和鱼体组成的影响。实验选取赤眼鳟鱼种810尾,随机分成9组,每组2个重复,饲养期6周。结果显示:饲料蛋白质和脂肪的交互作用对赤眼鳟的特定生长率有显著影响(P<0.05),饲料蛋白质水平对饲料系数影响显著(P<0.05),当饲料蛋白质水平为37%、脂肪水平为3.5%时赤眼鳟特定生长率最大,饲料系数最低。随着特定生长率的升高,赤眼鳟的肥满度和肌肉蛋白质的含量升高;赤眼鳟肌肉和肝脏脂肪含量均随着饲料中可消化能的增加而增加。

赤眼鳟形态特征及其两种同工酶的组织特异性分析

【目的】从形态特征和生化遗传层面上丰富赤眼鳟种质资源研究数据,同时为筛选出鉴定赤眼鳟种群的生化遗传标记打下基础。【方法】采用形态学测量观察赤眼鳟的形态特征,并以聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其不同组织(心脏、眼睛晶状体、肌肉、肝脏和肾脏)中的乳酸脱氢酶(LDH)和苹果酸脱氢酶(MDH),分析两种同工酶表达的组织特异性。【结果】赤眼鳟的眼上缘可见一红斑,鳃耙短而疏,主要形态特征为背鳍D.iii-7,胸鳍P.i-14,臀鳍A.iii-7~8,腹鳍V.i-8,其齿式2·4·5/4·4·2或2·4·4/4·4·2。从赤眼鳟的心脏、眼睛晶状体、肌肉、肝脏和肾脏等5种组织中共检测到7条LDH酶带和6条MDH酶带,不同组织中的酶带数目和活性各不相同,呈明显的组织特异性,且同一组织不同个体间也存在明显差异。【结论】同工酶表达的组织特异性除了受遗传基因调控外,还与各组织的生化代谢活动相关,其中心脏LDH可作为鉴定赤眼鳟种质的生化遗传标记。

草鱼×赤眼鳟F_1 与其亲本遗传性状的比较研究

采用生物统计方法，对草鱼、赤眼鳟及其杂种一代（草♀×赤♂、草♂×赤♀）的１０ 个数量性状进行统计分析，结果显示草♂×赤♀杂种的性状表现了明显的趋父性遗传，而草♀×赤♂杂种则表现了明显的趋母性遗传．用杂种指数衡量，在所测量的７ 个性状中，有５ 个偏向草鱼，只有体长／体高和脊椎骨数２ 个性状偏向赤眼鳟．这表明草鱼与赤眼鳟的杂交后代（Ｆ１）数量性状遗传受草鱼遗传因子的影响较大．