赤羽病病毒Gc aa465~704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465~704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc aa465~704蛋白,纯化后免疫小鼠;通过细胞融合和亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞,利用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)对mAb特性进行鉴定。结果显示,本试验成功筛选出1株可稳定分泌抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb的杂交瘤细胞株4D1,Western blot结果显示,mAb 4D1可特异性识别AKAV Gc aa465~704蛋白;IFA结果显示,mAb 4D1能够与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。结果表明,本试验成功制备抗AKAV Gc aa465~704蛋白mAb,为进一步研究AKAV Gc蛋白生物学功能和建立AKAV检测方法提供技术支持。

赤羽病病毒G1蛋白生物信息学分析及截短基因的真核表达

为得到赤羽病病毒(AKV)G1蛋白的截短表达产物作为诊断抗原,通过PCR扩增、酶切、连接、转化等技术手段,成功克隆出优势抗原结合表位区Thr189-Val 397对应的目的基因G1-2。将目的基因克隆至昆虫杆状病毒表达载体pFastBac HTB,将该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-AKV-G1-2,用Cellfectin ReagentⅡ介导转染sf9细胞,获得重组蛋白,Western blot法检测和分析重组蛋白表达情况。软件分析结果表明189~397 aa肽段为亲水性蛋白,存在跨膜区,该蛋白存在多个潜在的磷酸化位点,具有丰富的潜在抗原表位,属于优势抗原肽段,选取该肽段进行截短真核表达,以AKV抗体阳性血清进行Western blot鉴定,重组蛋白能被特异性识别,出现预期蛋白反应条带,表明G1-2蛋白成功表达,分子量约为27 kDa。本研究为进一步开展截短表达产物为抗原的赤羽病病毒诊断试剂研制奠定了基础。

赤羽病病毒核衣壳蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的重组赤羽病病毒核衣壳蛋白作为诊断抗原,建立了检测牛血清特异性核衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,初步组装成便于现地使用的试剂盒。经对试验条件进行优化,确定最佳抗原包被量为每孔1μg(100μL),样品稀释度为1∶100,兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶8 000。经特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。应用初步研制的间接ELISA试剂盒和微量中和试验法分别对云南省的89份、内蒙古的100份牛血清样本进行了检测,以中和试验为参照,经统计学处理,得出检测临界值分别为0.411和0.303,2种方法的符合率分别为72.7%(56/77)和91.4%(85/93)。试剂盒在37℃保存3 d,对敏感性无明显影响。

赤羽病病毒N基因硫氧还蛋白融合表达载体的构建与表达

为获得赤羽病病毒 (Akabanevirus ,AKAV )的核蛋白重组抗原 ,根据其基因序列(SmRNA)设计合成了 1对特异性引物 ,对AKAVN基因进行RT PCR扩增 ,产物大小约为 6 96bp ,回收纯化后 ,将其克隆至 pMD18 T质粒载体中 ,经核苷酸序列分析 ,与已报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白N的SmRNA基因比较后发现 ,所测定毒株的核苷酸序列与TIN毒株的同源性高达 98.3% ,推测的氨基酸同源性为 97.6 % ,证实为AKAV的N基因。将该基因片段亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体 ,转化TOP10细胞 ,成功地构建了AKAVN基因重组表达载体。经L araboinose诱导表达 ,可稳定、高效地表达AKAV核蛋白抗原。表达蛋白为融合蛋白 ,分子质量约 4 2 .5ku ,其表达产量约占菌体总蛋白的 2 8% ,融合蛋白中含有AKAV特异性核蛋白抗原 。

赤羽病病毒RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种赤羽病病毒(AKAV)的快速检测方法,本研究根据环介导等温扩增技术(LAMP)原理,设计了针对AKAV S基因的特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了AKAV的RT-LAMP方法。特异性和灵敏度试验结果显示,所建立的RT-LAMP检测方法具有良好的特异性,与蓝舌病、牛病毒性腹泻及传染性牛鼻气管炎等病毒无交叉反应,敏感度可达11.5拷贝/μL,采用SYBR Green I染色,肉眼即可判定检测结果。该方法能够简便、快速、灵敏、特异地检测AKAV。

赤羽病病毒RT-PCR检测方法的建立

利用BHK 2 1细胞繁殖赤羽病病毒 (AKV)美国株 ,以 30 %蔗糖垫底超速离心浓缩病毒。根据病毒SRNA序列设计 3对引物 ,初步建立了检测AKV的RT PCR方法 ,850bp扩增产物的序列与已知序列同源性 99%以上。人工攻毒鼠检测特异灵敏。

赤羽病病毒核衣壳蛋白基因的表达纯化及活性鉴定

为获得赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)核衣壳蛋白重组抗原,经RT-PCR扩增了OBE-1株的S节段,将其插入到pMD 18-T载体,然后用带有酶切位点的引物从该重组载体亚克隆出表达核衣壳蛋白的N基因,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后与同样处理的表达载体pET-28a(+)进行连接,转化感受态细胞BL21(DE3)。将筛选出的阳性克隆进行测序、IPTG诱导表达和融合蛋白纯化及活性鉴定。结果表明,N基因含有1个全长702 bp的ORF,编码233个氨基酸,通过SDS-PAGE和Western-blotting分析,证实重组菌株可高效表达有免疫活性的分子质量约27 ku的可溶性融合蛋白,用薄层扫描仪分析,其最高表达量占可溶性菌体蛋白总量的58.5%。工程菌经超声波裂解高速离心后,上清液在ProBondTMPurification System(含Ni2+)天然状态下纯化,可获得高纯度的融合蛋白。

赤羽病病毒核蛋白基因克隆和序列分析

参考GeneBank发表的赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)的核蛋白基因(SmRNA)序列,设计合成一对引物,从分离自牛体的AKAV BHK21细胞培养物中提取总RNA,对AKAV核蛋白基因进行RT-PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约696bp的条带,回收纯化后,将其克隆至pMD18-T质粒载体中,然后进行核苷酸序列分析.与GenBank中报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白(N)的SmRNA基因比较后发现,与其它株的核苷酸的同源性为94.2%～98.3%,推导的氨基酸的同源性为97.6%～100%,证实为AKV的N基因.为生产AKAV特异性核蛋白抗原、免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础.

赤羽病病毒N蛋白单克隆抗体的制备

为制备赤羽病病毒(AKAV)N蛋白的单克隆抗体(MAb),本实验利用原核表达系统表达、纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,并以纯化的重组N蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出1株稳定分泌抗AKAV N蛋白的MAb杂交瘤细胞株IIG5,检测结果显示IIG5为IgG1/κ链。间接免疫荧光结果显示,IIG5与AKAV感染细胞呈阳性反应,与茨城病病毒、中山病病毒以及蓝舌病病毒1型均呈阴性反应,特异性较好。Western blot结果显示,IIG5能够识别重组的以及AKAV感染细胞中的N蛋白。本研究结果为AKAV检测方法的建立及相关研究奠定基础。

赤羽病病毒检测方法研究进展

赤羽病是目前对养牛业和养羊业危害较为严重的疫病,在我国已广泛存在,一旦暴发将会给我国畜牧业造成严重的经济损失。迅速、准确的诊断是防制和消灭该病的重要前提。几十年来,赤羽病诊断技术经历了早期的病毒分离鉴定到血清学试验,再到分子生物学检测这一发展过程,正逐渐向着更敏感、更特异、更方便、更经济的方向发展。本文就赤羽病病毒的实验室检测技术研究进展作一综述。

赤羽病病毒检测方法研究进展

赤羽病是目前对我国养牛业和养羊业危害较为严重的疫病,该病在我国广泛存在,一旦暴发将给畜牧业造成严重的经济损失。为防治和消灭该病,必须迅速、准确地作出诊断。经过几十年的努力,赤羽病诊断技术从最早的病毒分离鉴定到血清学试验,再到分子生物学技术,已逐渐向着更敏感、更特异、更方便、更经济的方向发展。本文就赤羽病病毒的实验室检测技术研究进展作一综述。

赤羽病病毒的纯化及其单克隆抗体的制备

将人工繁殖、纯化的赤羽病病毒作为免疫原,通过常规杂交瘤技术,制备亲和性强、特异性好的小鼠抗赤羽病病毒单克隆抗体,并进行相应的纯化和标记工作。以澳大利亚进口的试剂盒进行验证,结果证明:进口单抗与我们制备的AAK纯品及AAK-HRP显示同样结果;且质控结果表明,AAK纯品及其衍生物AAK-HRP的特异性和亲和性均基本满足进行封闭ELISA检测方法的要求,为制备国产化ELISA试剂盒提供了基础。

赤羽病病毒检测方法研究进展

赤羽病是目前对我国养牛业和养羊业危害较为严重的疫病,该病在我国广泛存在,一旦暴发将对我国畜牧业造成严重的经济损失。为了防制和消灭该病,必须迅速、准确地作出诊断。经过几十年的努力,赤羽病诊断技术从最早的病毒分离鉴定到血清学试验,再到分子生物学技术,已逐渐向着更敏感、更特异、更方便、更经济的方向发展。文章就赤羽病病毒的实验室检测技术研究进展作一综述。

一种基于重组截短Gc_(aa407～614)蛋白的赤羽病病毒抗体间接ELISA方法的建立

为建立一种检测赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)抗体的ELISA方法,对Gc蛋白从407位至614位氨基酸的编码序列,经密码子优化后进行基因合成,然后克隆至重组表达载体PET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG在37℃进行诱导表达。用Ni^(+2)-NTA树脂亲和层析方法纯化重组蛋白(trGc_(aa407~614)),以Western blotting检测其抗原性;用纯化trGc_(aa407~614)建立间接ELISA方法(trGc_(aa407~614)-ELISA),并评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示:重组蛋白trGc_(aa407~614)以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,经Ni^(+2)-NTA树脂亲和层析纯化后的浓度2.4 mg/mL,纯度为94%,对山羊抗AKAV阳性血清呈现较好的抗原反应性;所建立的trGc_(aa407~614)-ELISA方法的最佳抗原包被浓度为4.0μg/mL,血清稀释度为1:80,血清阴阳性的OD450临界值为0.318;该方法对AKAV阳性血清呈特异性反应,组内试验和组间试验的变异系数均小于10%。用该方法对273份进口牛血清进行AKAV抗体检测,发现10份血清为阳性。总之,本研究建立的trGc_(aa407~614)-ELISA方法为血清样品中赤羽病病毒抗体的检测提供了有效手段。

赤羽病病毒Gc_(405aa—480aa)肽段的高效可溶性表达及抗原性鉴定

为表达和鉴定赤羽病病毒Gc蛋白强抗原性肽段,对Gc蛋白的1个75氨基酸肽段(405aa—480aa)编码序列,经密码子优化后进行基因合成,构建重组表达载体p ET-Gc_(405aa—480aa),转化表达菌株BL21(DE3),在28℃用0.1 mmol/L IPTG诱导重组肽段表达。将重组rHis-Gc_(405aa—480aa)肽段,通过Ni^+-NTA树脂亲和层析方法纯化后,用Western-bloting和ELISA分析其抗原性。SDS-PAGE显示,重组rHis-Gc_(405aa—480aa)肽段以完全可溶性形式在大肠杆菌中得到高效表达;用Ni+-NTA树脂亲和层析方法纯化,获得了较高纯度的重组rHis-Gc_(405aa—480aa)肽段;Western-blotting显示,该重组肽段对赤羽病病毒阳性血清具有很强的反应原性。本研究表达、纯化和鉴定了具有强抗原性的重组rHis-Gc_(405aa—480aa)肽段,为进一步开展Gc蛋白单克隆抗体制备、B细胞表位鉴定和诊断试剂研制奠定了基础。

牛赤羽病病毒感染的流行诊断及防控

病原和流行赤羽病病毒是布尼亚病毒科西姆布血清群病毒的成员。在澳大利亚、日本和肯尼亚,该病毒可经库蠓传播。赤羽病病毒普遍存在于北纬35°~南纬35°的许多热带和亚热带地区。在这些流行地区,草食动物被媒介虫体叮咬后可造成早期感染,到繁殖期一直都保持有长期免疫力,因此罕见有先天性畸形。但媒介在有利环境条件下,如长期潮湿的夏天,可能会传播到其正常范围以外,扩散到新的地区,预计可能会暴发先天性感染。同样,妊娠期反刍动物从无病毒和无媒介地区转移到病毒感染地区时,也面临很大风险。

赤羽病病毒N蛋白原核表达及单克隆抗体的制备

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞。经3次亚克隆筛选得到两株特异性针对AKAV N蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2C9与5E9。通过ELISA、免疫印迹(Western blotting)、间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)对其进行鉴定。结果显示,成功筛选到特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体。IFA发现其与AKAV N蛋白具有良好的反应性,亚型鉴定试剂盒鉴定2C9 mAb重链为IgG2b型,轻链为κ链;5E9 mAb重链为IgG1型,轻链为κ链;ELISA检测效价均为1:4 096 000。本研究成功制备了两株特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体,为赤羽病诊断方法的开发、疾病的防控以及AKAV N蛋白功能的研究奠定了基础。

赤羽病微量病毒中和试验诊断方法的研究

应用引自日本的赤羽病病毒 ,制备了微量病毒中和试验抗原和高免阳性血清 ,建立了赤羽病微量病毒中和试验诊断方法。应用此方法对广东省 72 4头牛血清进行了检查 ,阳性率为 35 .3% ,对上海 6 6 5头牛血清作了检查 ,阳性率为 6 7.7% ,说明这些地区曾流行过赤羽病。同时对澳大利亚当地牛 10 8头进行检查 ,阳性率为 5 5 .5 % ,与国外报道一致。对澳大利亚、加拿大、美国进口牛 173头的检查结果 ,全部阴性。对澳大利亚进口羊 992头的检查结果 ,发现阳性 1头 ,已得到澳方认可。

赤羽病病毒套式RT-PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank中已发表的赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了3条特异性引物,建立了检测AKAV的套式RT-PCR方法。特异性试验表明,该方法可以特异扩增出AKAV的S基因片段,但从牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)等13种对照病毒中均不能扩增出目的条带。敏感性试验表明,套式RT-PCR能够扩增10-5稀释度的病毒RNA(核酸含量约1.18 ng/μL),比普通RT-PCR高出1 000倍。用此方法检测130份奶牛血清样品与1份流产胎儿病料,均未检测到阳性样本,但AKAV在血清模拟样品中可被有效检出。研究结果表明,该方法灵敏、特异,为AKAV的检测提供了一个快速、有效的手段。

赤羽病病毒核衣壳蛋白原核表达及单克隆抗体制备

为制备赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)核衣壳(N)蛋白单克隆抗体,本研究构建了pET-28aAKAV-N重组质粒,并将其转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达和镍柱纯化获得重组N蛋白。用重组N蛋白4次免疫小鼠后,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,利用亚克隆技术和ELISA方法筛选出4株阳性细胞株,分别命名为2D3、5F10、1F4和5D4,并对其进行特异性分析。免疫印迹(Western-blot)结果显示,2D3仅识别AKAV-N蛋白,5F10、1F4和5D4均能够同时识别AKAV-N和施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)N蛋白;间接免疫荧光(IFA)结果显示,2D3、1F4和5D4与AKAV感染的BHK21细胞呈阳性反应,而5F10为阴性。亚型检测结果显示,2D3抗体为IgG2a/к型,5F10、5D4抗体为IgG1/к型,1F4抗体为IgG1/λ型。综上所述,本研究获得的单克隆抗体能够为AKAV-N蛋白的相关研究提供支持。