小麦木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21的克隆及赤霉病菌诱导下的表达分析

木瓜类半胱氨酸蛋白酶(PLCPs)作为一类重要的蛋白水解酶,在植物生长发育以及胁迫应答过程中都发挥着重要作用。本研究从抗、感赤霉病小麦品种差异表达基因谱中获得1个注释为RD21 Cysteine proteases的EST(表达序列标签),以此序列检索小麦最新基因组数据库并设计引物,从小麦中克隆到3个基因,分别命名为TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D,属于PLCPs RD21家族。序列分析表明,3个基因的开放阅读框长度分别为1410、1428和1419 bp,分别编码469、475和472个氨基酸。序列比对发现,3个基因的序列相似性为89.3%,所编码蛋白的氨基酸序列相似性为95.6%。系统进化分析表明,TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D蛋白的同源性较高,且与乌拉尔图小麦TuRD21A蛋白聚为一类。qRT-PCR分析表明,3个TaRD21基因均受水杨酸(SA)、乙烯利(ETH)以及赤霉病菌诱导表达;感病品种中,TaRD21-2A对SA和赤霉病菌的响应更迅速,且表达量较高;抗病品种中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因对ETH的响应更迅速。

小麦-赤霉病菌互作研究进展

小麦赤霉病是在高温、高湿环境下由禾谷镰刀菌侵染引起的小麦真菌性病害,是对小麦生产造成威胁的主要病害之一。近年来,由于温室效应和轮作制度的共同作用,该病害频发,严重威胁小麦的产量和质量。本文对小麦赤霉病的流行特点和危害、致病机制、抗性基因及小麦-赤霉病菌互作的研究进行综述,并就目前小麦赤霉病抗病育种及抗病基因利用等方面需要解决的问题和挑战进行展望,以期为广大学者开展小麦-赤霉病菌的互作研究提供参考。

小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性研究

测定了 1976年从江苏南京采集的 54株小麦赤霉病菌菌株对多菌灵的敏感性 ,EC50 值在 0 .2 6 17～ 0 .6 544 μg.m L-1之间 ,1983年在同一地点采集的 76株 ,EC50 值相应为0 .2 517～ 0 .70 50 μg.m L-1,而 1998年从浙江、湖北、上海、福建、安徽、江苏各地采集的 10 4株菌株 EC50 值为 0 .2 4 78～ 6 .4 574 μg.m L-1,表明湖北、上海、浙江等地田间已检测到小麦赤霉病菌抗多菌灵菌株。紫外光诱导分生孢子也获得了该病菌抗多菌灵突变株 ,其 EC50 值为14.1993μg.m L-1。抗药性突变体 JPR与敏感亲本菌株 JPS相比 ,在菌丝生长、产孢量方面无明显差异 ,但 JPR孢子萌发率为 57.1% ,而 JPS为 10 0 % ,而且 50 %孢子萌发的时间较野生亲本菌株滞后 12 h。 JPR产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON毒素 ) 3.90μg.m L-1,而 JPS产生的DON毒素为 9.2 8μg.m L-1。

丁布对小麦赤霉病菌和玉米小斑病菌的抑制作用

采用菌丝生长速率法和孢子萌发试验法检测了抗菌化合物丁布对小麦赤霉病菌和玉米小斑病菌的抑菌作用。结果表明,丁布在PDA培养基中浓度为0.2-1.0 mg/ml时对两种供试病菌的菌丝生长无抑制作用;丁布浓度为0.4-1.0 mg/ml时对两种供试病菌孢子悬浮液中孢子的萌发具有显著抑制作用;1.0 mg/ml丁布药液中培育15h的小麦赤霉病菌和培育5h的玉米小斑病菌的孢子萌发抑制率分别达到100%和83.6%。

小麦赤霉病菌拮抗菌AF0907的分离鉴定及其拮抗特性

为了分离筛选对小麦赤霉病菌有拮抗作用的细菌,并研究其拮抗特性。采用系列稀释法和平板对峙法从土壤中分离筛选小麦赤霉病菌拮抗菌;采用16 SrDNA序列分析和生理生化特性进行拮抗菌的鉴定;采用平板对峙法研究拮抗菌的拮抗谱;通过田间喷施试验研究拮抗菌对小麦赤霉病的防治效果。结果显示:从土壤中分离筛选到小麦赤霉病菌拮抗菌AF0907,根据其形态、生理生化特性以及16 SrDNA序列分析,菌株AF0907被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。AF0907对10种常见的植物病原菌都具有拮抗效果;菌株AF0907可以抑制禾谷镰刀菌菌丝的生长,也能抑制病原菌孢子的萌发。田间试验结果显示:拮抗菌AF0907可以有效地降低小麦赤霉病的发病率,先喷施拮抗菌液再喷施赤霉孢子液处理下防治效率可以达到40.37%。

β_1-和β_2-微管蛋白基因在赤霉病菌抗多菌灵中的作用

【目的】揭示β1-微管蛋白基因(β1-tub)和β2-微管蛋白基因(β2-tub)在赤霉病菌(Gibberella zeae)对多菌灵的抗性过程中所起的作用。【方法】采用PCR克隆测序法测定Js449(EC50=7.911μg·m L-1)、Js462(EC50=6.515μg·m L-1)、Js484(EC50=5.031μg·m L-1)、Js506(EC50=8.455μg·m L-1)和Js519(EC50=6.280μg·m L-1)等5个多菌灵抗性菌株的α-、β1-、β2-、γ-tub序列,并与敏感菌株HG-1(EC50=0.552μg·m L-1)进行比对。采用实时荧光定量PCR(q PCR)测定β1-tub和β2-tub在多菌灵胁迫下的抗性菌株Js506中的相对表达量。构建β1-tub和β2-tub的超量表达载体,分别在HG-1中表达。运用split PCR获得含有潮霉素磷酸转移酶基因和目标基因的融合片段,并对Js506进行原生质体转化,通过同源重组获得β2-tub的敲除体和互补体。对菌株Js506、HG-1及其突变体分别进行多菌灵敏感性测定、菌落生长观察和致病力测定。【结果】基因比对结果表明,5个抗性菌株的α-、β1-、γ-tub基因序列与敏感菌株的一致。对β2-tub序列比对结果表明,Js449、Js462和Js506菌株的第167位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)变为酪氨酸(Tyr)。Js484菌株的第200位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)变为酪氨酸(Tyr)。Js519菌株的第198位氨基酸由谷氨酸(Glu)变为谷氨酰胺(Gln)。5μg·m L-1多菌灵能诱导Js506菌株的β1-tub表达量显著上调(P<0.05)。10μg·m L-1的多菌灵对Js506菌株的β2-tub表达量影响不显著。β1-tub的超量表达使HG-1突变体的EC50增加至2.839μg·m L-1,抗药性显著增强(P<0.05)。β2-tub超量表达突变体的抗性水平与野生型菌株无显著差异。对Js506菌株的β2-tub进行敲除试验,分别获得了2个转化体(△β2tub-Js506-1、△β2tubJs506-2),经潮霉素抗性筛选、PCR和Southern杂交验证,确认2个转化体均不含有β2-tub。与野生型菌株Js506相比,敲除体△β2tub-Js506-1(EC50=0.078μg·m L-1)和△β2tub-Js506-2(EC50=0.072μg·m L-1)对多菌灵均表现为超级敏感,且菌落生长变慢,致病力显著下降(P<0.05)。对△β2tub-Js506-1进行互补转化获得了2个互补体,β2tub-Js506-C1(EC50=7.521μg·m L-1)和β2tub-Js506-C2(EC50=7.243μg·m L-1),2个互补转化体均使敲除体△β2tubJs506-1基本恢复了抗性、菌落生长速率和致病力。【结论】5个赤霉病菌菌株对多菌灵的抗性与β2-tub的第167、198、200位密码子突变有关,与α-、β1-和γ-tub序列的突变无关。β1-tub在多菌灵胁迫下诱导表达,且β1-tub的超量表达能增强赤霉病菌对多菌灵的抗性。β2-tub是小麦赤霉病菌对多菌灵抗性所必需的,β1-tub和β2tub均能影响赤霉病菌对多菌灵的抗性。

河南省小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性

为明确河南省小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性,采用菌丝生长速率法测定了戊唑醇对2016年自该省11个县(市)分离的113株病菌菌丝生长的毒力。结果表明,戊唑醇对小麦赤霉病菌菌丝生长最低抑制浓度为4μg·mL-1,对供试菌株的EC50值变化范围为0.010～0.237μg·mL-1,平均EC50为0.057±0.041μg·mL-1;敏感性频率分布图显示,病菌群体中虽然出现了对戊唑醇敏感性下降的亚群体,但仍有81.4%的菌株的敏感性频率呈正态分布,可将此部分菌株的平均EC50值(0.041±0.016μg·mL-1)作为小麦赤霉病菌对戊唑醇的敏感性基线;方差分析(LSD法)及SPSS聚类结果均显示,同一县(市)内的菌株对戊唑醇的敏感性差异较大,EC50最大值和最小值之比变化范围为1.10～14.23,而除周口沈丘及洛阳孟津菌株外,其余地区菌株对戊唑醇敏感性差异不明显,对戊唑醇的EC50平均值变化范围为0.038～0.101μg·mL-1,相差2.66倍;小麦赤霉病菌对戊唑醇与其对多菌灵、咯菌腈的敏感性之间无明显相关性。戊唑醇依然可以应用到河南省小麦赤霉病的化学防治上,但生产中应持续监测病菌对药剂的敏感性变化。

蛇床子素对小麦赤霉病菌葡萄糖、钙吸收和三磷酸腺苷酶活性的抑制

蛇床子素可抑制小麦赤霉病菌菌丝生长干重;含有14C标记的葡萄糖培养基中培养小麦赤霉病菌,以100μg/mL蛇床子素处理,其菌体内14C放射强度比对照降低43%,表明蛇床子素能抑制小麦赤霉病菌对葡萄糖的吸收;以100μg/mL蛇床子素处理小麦赤霉病菌12h,菌体内总钙含量仅为对照的60%,表明蛇床子素能抑制菌体对钙的吸收;蛇床子素处理对β-1,6葡聚糖酶活性没有显著影响;离体条件下,蛇床子素能抑制小麦赤霉病菌三磷酸腺苷(ATP)酶活性。

赤霉病菌拮抗菌Bacillus subtilis AF0907抗菌物质研究

菌株AF0907是从土壤中分离到的1株对小麦赤霉病菌具有显著拮抗作用的枯草芽孢杆菌,该菌株不仅对小麦赤霉病菌具有很好的拮抗活性,对其他多种植物病原菌都具有很好的拮抗效果。为了明确菌株AF0907对赤霉病菌的抑菌机理,本研究首先使用平板对持法对拮抗物质进行定位,结果表明该菌分泌的拮抗物质主要位于细胞上清液中。采用不同饱和度的硫酸铵沉淀细胞上清液,确定了60%的硫酸铵饱和度是沉淀该拮抗物质的最佳条件;分别研究了温度、p H值、蛋白酶K、氯仿对该拮抗物质活性的影响,结果表明该拮抗物质在低温下比较稳定,在60℃以上的高温下,活性迅速降低;在酸性或碱性条件下不稳定;该拮抗物质分别加入蛋白酶K和氯仿作用后拮抗活性分别下降了60.68%、80.07%,因此,初步判断该拮抗物质为蛋白质。利用DEAE-52离子交换柱层析法分离纯化了该拮抗蛋白并进行了SDS-PAGE电泳,结果显示该拮抗蛋白的分子量为48 k Da;利用PPSQ-31A蛋白自动测序仪测定拮抗蛋白N-末端15个氨基酸序列为:His-Glu-Phe-Pro-Thr-Tyr-Lys-His-Met-Tyr-Gln-Val-Met-His-Leu。

小麦赤霉病菌拮抗内生菌的抑菌活性及鉴定

为开发看麦娘内生菌生物防治资源,通过离体拮抗试验、生防试验和分子鉴定等方法,研究了野生日本看麦娘内生真菌KMN-1和KMN-11对小麦赤霉病菌的抑菌活性以及菌株的分类地位。离体生物测定结果表明,2株内生菌对小麦赤霉病菌的菌丝生长有明显拮抗作用,KMN-1和KMN-11菌株发酵液抑制小麦赤霉病菌菌丝生长的EC50值分别为6 572.97 mg·L-1、5 218.34 mg·L-1。进一步采用离体麦穗和田间小区系统研究KMN-1和KMN-11发酵产物对小麦赤霉病的防治效果,结果表明KMN-1和KMN-11对小麦赤霉病均表现一定的防治作用。离体麦穗上,KMN-1发酵产物对小麦赤霉病的保护和治疗作用防治效果分别为78.13%、76.52%;小区生防试验中,2株内生菌代谢产物均可降低小麦赤霉病的发病程度。经形态特征和分子学鉴定,初步确定KMN-1菌株为细极链格孢(Alternaria tenuissima),KMN-11菌株是变红镰孢(Fusarium incarnatum)。本研究表明从镰孢属和链格孢属内生菌中寻找生防菌株的前景广阔,为进一步研究开发有潜力的农用抗生素奠定了基础。

抗苯并咪唑的小麦赤霉病菌β-tubulin基因序列分析与特性研究

本研究用真菌 β-微管蛋白基因的通用寡聚核苷酸引物 B1和 B3,扩增并克隆了一段 82 1bp的小麦赤霉病菌 Fusarium graminearum的 β-微管蛋白基因片段 ,并进行了序列测定。根据该序列设计了 F.graminearumβ-微管蛋白基因的特异性测序引物 ,测定了赤霉病菌对多菌灵不同抗感菌株的β-微管蛋白基因核苷酸序列 ,结果表明不同 F.graminearum菌株的 β-微管蛋白的 16 5,198,2 0 0和 2 57位氨基酸未发生突变 ,在克隆的片段内也未发现核苷酸突变引起的氨基酸改变。表明该菌对多菌灵产生抗性的分子机制与目前已知的其它真菌有所不同 ,有待进一步研究。

一种基于LAMP技术快速检测小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性方法的建立及应用

[目的]传统的植物病原菌抗药性检测方法存在检测周期长、操作繁琐、效率低等诸多缺点,建立一种小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)对多菌灵抗药性快速检测的方法尤为重要。[方法]基于环介导等温扩增技术(LAMP),以小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性基因型F167Y的β2微管蛋白基因为靶标,经过人工错配,设计并筛选LAMP特异引物,对检测体系各组分浓度配比进行优化,并通过人工接种试验验证该检测技术的可靠性。[结果]建立了一种小麦赤霉病菌对多菌灵抗性的快速、高通量的分子检测技术,该检测技术能特异性鉴定小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性菌株;证实了该检测技术在生产中可靠、稳定、可操作性强,具有广阔的应用前景。[结论]该检测方法是LAMP技术在小麦赤霉病菌抗药性监测中的首次应用,可用于抗药性群体的动态监测与抗性风险评估,为小麦赤霉病的抗药性治理提供用药指导。

湖北省小麦赤霉病菌对多菌灵、戊唑醇和咪鲜胺的敏感性

对2014年采自中国湖北省7个县、市的206株小麦赤霉病菌样品进行单孢分离与鉴定,并采用菌丝生长速率法随机测定了其中100株菌株对多菌灵、戊唑醇和咪鲜胺的敏感性,建立了其敏感基线。结果表明：多菌灵、戊唑醇和咪鲜胺对湖北省小麦赤霉病菌的EC50值范围分别为0.115-0.705、0.006-1.356和0.002-0.370μg/m L,平均值分别为0.248、0.181和0.040μg/m L;供试100株小麦赤霉病菌对3种药剂的敏感性频率均呈单峰拟正态分布,因此可将所得各EC50平均值分别作为湖北省小麦赤霉病菌对3种药剂的敏感基线参考值。以各药剂EC50平均值的10倍作为敏感性鉴别浓度,对2015及2016年湖北省小麦赤霉病菌的敏感性进行了监测,在该鉴别浓度下,多菌灵、戊唑醇和咪鲜胺对2015年小麦赤霉病菌的平均抑制率分别为100%、85.14%和82.35%,对2016年小麦赤霉病菌的平均抑制率分别为100%、76.67%和73.62%。研究表明,虽然戊唑醇和咪鲜胺对2016年小麦赤霉病菌的抑制率略有下降,但整体而言,湖北省小麦赤霉病菌对多菌灵、戊唑醇及咪鲜胺仍具有较高的敏感性。

抑制差减杂交分离赤霉病菌诱导的小麦特异表达基因

为了全面探索小麦赤霉病抗性机理，以抗赤霉病小麦品种‘苏麦3号’及其感病的近等基因系（Hw04）为实验材料，构建了一个‘苏麦3号’受赤霉病菌诱导表达的正向差减杂交文库。随机选取了141个阳性克隆测序，共获得133条通读EST。将获得的EST去除载体及接头序列后，利用CAP3软件进行聚类分析，133条EST被聚成90个序列重叠群（contigs），片段大小介于106-643bp间，平均长度为274bp。利用NCBI的Blastx软件对序列进行蛋白序列同源性比对，结果显示76条序列在蛋白数据库中可以找到同源序列，功能涉及能量代谢、物质代谢、疾病／防御、转录及细胞结构等。其中以能量及物质代谢相关的基因数量最多，分别占总EST的21．1％及17．1％；其次是与抗病及防御反应有关的EST，数量占总EST的15．8％。进一步的分析表明与抗病及防御相关的EST功能主要涉及抗氧化、细胞解毒及相关物质的代谢。

不同基因型大麦离体培养花药对赤霉病菌粗毒素的反应

研究了在离体培养条件下,大麦耐、感赤霉病基因型花药对赤霉病菌粗毒素的反应。结果表明:随着赤霉病菌粗毒素预处理浓度的提高,大麦花药愈伤组织诱导率降低,愈伤组织的绿苗分化率降低。耐病基因型的愈伤组织诱导率和绿苗分化率的降低幅度均小于感病材料。说明大麦个体水平的耐、感赤霉病性与花药水平对赤霉病粗毒素反应具有一致性。

小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性与α_2-微管蛋白序列无关析

【目的】研究小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性与α2-微管蛋白基因的相关性。【方法】比较对多菌灵不同敏感性水平菌株间在药剂作用下的形态学特征及其α2-微管蛋白基因异同。【结果】当敏感菌株和田间中抗菌株均在各自EC50和EC90浓度作用下,两者分生孢子芽管和初生菌丝均表现畸形,肿胀,分支增多。根据小麦赤霉病菌核基因组测序菌株NRRL31084（PH-1）的α2-微管蛋白基因核苷酸序列设计4对引物,采用PCR方法克隆并测定了小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）对多菌灵（MBC）不同敏感性表型的8个中国菌株的α2-微管蛋白基因全序列。DNA序列比对结果表明中国的4个敏感菌株和4个抗药性菌株的α2-微管蛋白基因核苷酸序列同源性没有差异,多菌灵抗药性与α2-微管蛋白无关。该基因全长1712bp,含有4个内元,编码453aa;与NRRL31084的α2-微管蛋白基因核苷酸序列同源性为99%,存在5个差异核苷酸,与其所编码的氨基酸序列同源性为100%;与其他9种真菌α2-微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为64%-89%。【结论】小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性与α2-微管蛋白序列无关。

小麦赤霉病菌对多菌灵和不同杀菌剂敏感性的相关分析

为探明江苏省小麦赤霉病菌[Gibberella zeae(Schwein.)Petch]对多菌灵的抗药性和该药剂与其他杀菌剂的交互抗性,采用区分剂量法检测了采自江苏省26个县(市)的520株小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性,并采用菌丝生长速率法分别检测了对多菌灵不同敏感性的10个菌株对嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑胺菌酯、氟环唑、己唑醇、灭菌唑和咯菌腈等杀菌剂的敏感性。结果表明:江苏省各县(市)菌株对多菌灵的抗性频率差异较大,总抗性频率为50.58%;通过EC_(50)值相关性分析,小麦赤霉病菌对多菌灵和上述杀菌剂之间不存在交互抗性。江苏省小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性频率较高,迫切需要筛选新的杀菌剂防治小麦赤霉病。

四川省小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性

以1.4mg/L多菌灵作为鉴别剂量,在PDA平板上对四川省16个地区的239个小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)进行了抗药性测定,检测得到40个对多菌灵具有抗性的菌株,占总菌株的16.736%。用菌落直径法测定了102个敏感菌株和40个抗药性菌株的EC50值,平均值分别为(0.5870±0.0139)mg/L和(0.6431±0.0362)mg/L,抗药菌株对多菌灵均表现为低抗。

小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性的研究——Ⅱ.抗性检测和诱导

江苏、福建、湖北和黑龙江等省的609个菌株在1ppm 多菌灵(MBC)的 PDA 平板上不能生长或生长严重受阻,其 ED_(50)都小于1ppm,说明无抗性菌株存在。ED_(50)分别为福建0.32ppm,湖北0.54ppm,江苏0.45ppm,黑龙江0.65ppm。经多次抗性诱导,获得能抗10ppmMBC 的菌株 J-8,但未得到高抗菌株。几种镰孢菌(Fusarium spp.)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)抗性诱导和驯化结果说明,镰孢菌较灰葡萄孢不易产生抗性。

昆虫病原线虫共生菌对小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌的抑菌活性

为探索小麦根腐病和小麦赤霉病可持续控制的有效生防途径,以小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌作为供试真菌,评价了昆虫病原线虫共生菌及其毒素的抑菌活性,并对高毒力菌株抗逆性进行了初探。结果表明,供试的28个昆虫病原线虫共生菌发酵液和毒素均有一定的抑菌活性,其中,高毒力共生菌菌株SY5发酵液和毒素对小麦根腐病菌的抑菌率分别为56.05%和67.41%,对小麦赤霉病菌的抑菌率分别为82.41%和83.32%;菌株SY5发酵液经50℃处理60 min及18 W紫外灯照射120 min后对小麦根腐病菌的抑菌率无明显变化,但对小麦赤霉病菌的抑菌率有所下降;常温保存150 d,抑菌活性略有下降。说明共生菌菌株SY5对小麦根腐病菌和小麦赤霉病菌抑菌活性显著,且具有一定的抗逆性,极具应用潜力。