花生赤霉素2-氧化酶基因的克隆和表达研究

赤霉素2-氧化酶(GA2ox)是赤霉素合成过程中起负调控作用的一种关键酶,催化有活性的赤霉素生成无活性的赤霉素。从花生荚果发育不同时期的转录组序列中筛选到GA2ox的基因片段,采用5'-RACE方法克隆了花生GA2ox基因的全长cDNA序列。序列分析表明,花生GA2ox蛋白氨基酸序列含有和其他植物同样保守的结构域。通过qRT-PCR技术对GA2ox基因在花生不同组织器官中的表达分析,发现所检测的10种组织中均有GA2ox的表达,其中成年叶片中表达最丰富,根、刚入土的果针次之。本研究结果为进一步分析该基因在花生生长发育过程中的作用提供了有用信息。

高羊茅赤霉素2-氧化酶编码基因的克隆及功能验证

赤霉素(GA)是一类重要的植物激素,在植物的生长发育过程中发挥着重要作用。许多赤霉素代谢途径关键酶的编码基因已经被克隆和研究,但在高羊茅(Festuca arundinacea)中尚未见报道,利用RACE技术获得了高羊茅赤霉素2-氧化酶基因(FaGA2ox)。结果表明:FaGA2oxcDNA全长1566bp,包含1026bp开放阅读框,编码一个由341个氨基酸组成的蛋白质。FaGA2ox转基因烟草(Nicotiana tabocum)表现出赤霉素缺陷的表型,叶片面积明显变小,且叶片褶皱,叶片颜色暗绿,节间长度明显变短。综上所述,FaGA2ox在烟草中的过量表达可以导致植株矮化,为进一步利用该基因转化高羊茅培育矮化植株奠定基础。

太子参2个赤霉素2-氧化酶基因的克隆与序列分析

目的克隆太子参Pseudostellariae Radix赤霉素2-氧化酶(gibberellin2-oxidase,GA2ox)基因,并进行生物信息学和表达分析。方法通过对太子参转录组数据库的分析,得到2个太子参GA2ox基因PhGA2ox1和PhGA2ox8。。采用反转录PCR(RT-PCR)和特异PCR技术获得2个基因的蛋白编码区(coding sequence,CDS),并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测基因的表达模式。结果生物信息学分析表明,PhGA2ox1和PhGA2ox8的CDS区分别长981和1 056 bp,编码326和351个氨基酸残基,蛋白相对分子质量分别为36 871.3和40 169.9,理论等电点为8.66和6.91,具有GA2ox的保守结构域DIOX_N和20G-Fell_Oxy,但均无明显疏水区,无跨膜结构域,无信号肽,为稳定蛋白。序列系统进化分析显示植物GA2ox蛋白可被分为3个亚类,PhGA2ox1和PhGA2ox8分别归入Class I和Class III亚类。qPCR分析显示,PhGA2ox1在不同组织器官中的表达基本恒定,而PhGA2ox8在块根木质部的表达量却显著高于在其他组织器官中的表达量(P<0.05)。结论首次获得PhGA2ox1和PhGA2ox8基因的编码区序列,为进一步分析2个基因在太子参生长发育过程中的作用奠定了基础。

高等植物赤霉素2-氧化酶基因的克隆、表达及其调控

赤霉素(GA)是一类重要的植物激素,对高等植物整个生命周期的生长发育起关键作用。调控赤霉素生物合成和代谢途径中的关键酶基因的表达可以控制植物体内赤霉素的含量。GA2-氧化酶是调节赤霉素合成和代谢的关键酶之一,使活性GA失活。本文主要对GA2-氧化酶基因的克隆、表达调控及其在植物基因工程中的应用等方面进行综述,为通过基因工程技术调控植物体内活性赤霉素的含量从而得到改良品种提供思路。

烟草赤霉素2-氧化酶基因NtGA2ox1的克隆、表达及亚细胞定位分析

赤霉素2-氧化酶(GA2ox)通过2-β-羟基化作用产生失活的赤霉素,进而调节植物体内的赤霉素的活性水平。前期,本研究在烟草侧枝发育突变体转录组数据中,发现一个赤霉素2-氧化酶基因,其表达水平与野生型相比存在显著差异,命名为NtGA2ox1。为了更好地研究该基因在烟草侧枝发育中的作用,本研究从普通烟草中分离克隆了NtGA2ox1基因。通过测序分析该基因的编码及全长序列,发现NtGA2ox1基因含有2个外显子和1个内含子,编码一条长度为379个氨基酸的序列。同源进化分析表明,该基因在多种植物中存在同源序列,特别是茄科植物。组织特异性表达分析发现,NtGA2ox1基因在烟草的各个生长阶段均有表达,其中,在花和根中表达量较高。同时,激光共聚焦显微镜结果表明,YFP-NtGA2ox1融合蛋白在细胞质和细胞核中有很强的荧光信号,表明NtGA2ox1蛋白很可能定位于细胞核和细胞质中。本研究为进一步研究赤霉素调控烟草侧枝发育提供了理论依据。

‘南通小方柿’GA2ox基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】从地方矮化品种‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn.cv.Nantongxiaofangshi)中分离赤霉素合成关键酶基因GA2ox,并进行亚细胞定位及表达分析,为进一步探索其矮生性状形成机理及选育新型矮生品种奠定基础。【方法】以‘南通小方柿’幼嫩叶片为材料,通过改良的CTAB法提取总RNA,利用简并引物克隆GA2ox家族中2个基因的片段,采用3′和5′RACE方法得到基因的全长c DNA序列,分别命名为Dk GA2ox1和Dk GA2ox2。通过生物信息学方法分析结构特征,利用GFP进行亚细胞定位,实时荧光定量RT-PCR技术研究其在发芽期、展叶期、枯顶期、开花期、生理落果期、果实着色期、果实成熟期中的表达特性。【结果】生物信息学分析Dk GA2ox1和Dk GA2ox2全长c DNA序列分别为1 318 bp和1 267 bp,分别含有198 bp和61 bp的5′非翻译区及97 bp和172 bp的3′非翻译区。编码332个和334个氨基酸,与毛白杨(JX102472.1)、夹竹桃(AY594292.1)、烟草(AB125232.1)、矮牵牛(GU059939.1)、苹果(FJ571521.1)、梨(JF441168.1)、葡萄(JQ608472.1)的相似度达73%—77%。含有保守20G-Fe(Ⅱ)-Oxy蛋白结构域,高度保守的2-酮戊二酸结合位点(Dk GA2ox1:Arg-272、Ser-274;Dk GA2ox2:Arg-271、Ser-273)和Fe2+结合位点(Dk GA2ox1:His-205、Asp-207、His-262;Dk GA2ox2:His-204、Asp-206、His-261),有赤霉素2-氧化酶蛋白家族共同的结构特点。Dk GA2ox1和Dk GA2ox2编码蛋白分子量分别为36 596.1 Da和37 544.2 Da,均为稳定蛋白,无信号肽,无跨膜结构域,无明显疏水区,属于C19-GAoxs。瞬时表达载体的构建及洋葱表皮细胞转化后,洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,Dk GA2ox1编码蛋白定位于细胞核和细胞质中。Dk GA2ox1和Dk GA2ox2在开花期表达最丰富,并在7个典型物候期中均高于乔化品种‘大方柿’。【结论】南通小方柿中赤霉素2-氧化酶基因的表达与其矮生性状有关。

广藿香PcGA2ox1基因克隆、VIGS载体构建和表达分析

赤霉素2-氧化酶(gibberellin 2-oxidases,GA2ox)是赤霉素(GAs)代谢途径关键酶,调节活性GAs降解,在植物株型调控中发挥重要作用。为探寻GA2ox基因在广藿香中的功能,本研究对广藿香PcGA2ox1基因进行克隆,得到561 bp的CDS序列。生物信息学分析结果表明,PcGA2ox1蛋白编码186个氨基酸,为亲水性蛋白,分子量为20.98 kDa,等电点为5.81,不含信号肽,无跨膜结构域,具有GA2ox超基因家族的保守结构域,主要定位在细胞核。系统发育分析结果显示,PcGA2ox1基因与丹参GA2ox7的亲缘关系最为密切。qRT-PCR结果显示,PcGA2ox1基因在广藿香中的表达具有组织特异性,叶中表达量最高,根中表达量最低。用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术侵染广藿香的结果显示,侵染两周后,PcGA2ox1基因表达量比阴性对照下降83%,比空白对照下降71%,沉默效果明显。本研究结果可为深入了解PcGA2ox1结构、功能和作用机理奠定基础,并为广藿香优良品种选育提供参考。

西洋参PqGA2ox基因的克隆与序列分析

目的克隆、分析西洋参Panax quinquefolium种子萌发过程的赤霉素2-氧化酶(gibberellin 2-oxidase,GA2ox)基因。方法从前期由高通量测序得到78207条unigenes基因的注释信息中挖掘出与赤霉素合成和分解代谢相关的基因序列,得到11条GA2ox基因相关序列,通过序列比对分析确定GA2ox的转录本。根据选定的unigene序列设计引物,采用PCR方法扩增西洋参GA2ox的cDNA全长;利用生物信息学方法分析所得基因,并用实时荧光定量PCR技术进行表达分析。结果得到一条长度为987bp,编码328个氨基酸残基的西洋参GA2ox基因,命名为PqGA2ox。生物信息学预测PqGA2ox蛋白不含跨膜区,不含信号肽,具有依赖于2-酮戊二酸和Fe2+的双加氧酶超家族的保守结构域。实时荧光定量PCR结果显示在形态休眠中期和生理休眠中期的表达量低于其休眠起始期和解除休眠期。结论首次获得西洋参种子PqGA2ox基因的编码区序列,为进一步研究西洋参种子解除休眠的分子机制奠定基础。

MaGA2ox12基因在香蕉中的克隆、亚细胞定位及表达分析

为了比较MaGA2ox12在威廉斯香蕉(Musa acuminata,AAA group)‘8818’及其矮化突变体‘8818-1’的序列差异和表达差异,本研究分别以威廉斯‘8818’及‘8818-1’的假茎为试材,同源克隆MaGA2ox12基因的g DNA及启动子序列,比较它们在基因组测序品种DH-Pahang以及威廉斯‘8818’和‘8818-1’中的序列差异。结果表明‘,8818’和‘8818-1’间MaGA2ox12的g DNA与启动子序列的相似性分别为99.93%和99.86%,而威廉斯品种与DH-Pahang间,MaGA2ox12基因无论g DNA序列还是启动子序列均存在较大差异(分别为98.13%和87.14%),且MaGA2ox12的启动子存在较多光响应和激素响应元件。MaGA2ox12具备GA2ox基因家族的特征,同源进化分析发现其与海枣、油棕亲缘关系最近,属于C20-GA2ox类型。亚细胞定位显示MaGA2ox12蛋白定位于细胞核上。RT-qPCR结果表明,MaGA2ox12在巴西、贡蕉、‘8818’果实发育时期下调表达,在‘88181-1’中上调表达,调控具有品种特异性,Ma GA2ox12极其可能是调控果实和假茎中赤霉素含量的主要酶之一。