高等植物赤霉素20-氧化酶基因的克隆、表达及其调控技术的研究进展

揭示赤霉素20-氧化酶基因的分子特征,通过转基因技术调控植物体内活性赤霉素的含量,可为改良品种提供新的思路。从赤霉素20-氧化酶基因的克隆、表达调控及其在植物基因工程中的应用等方面进行了综述。

水稻赤霉素20-氧化酶基因(rga5)的正、反义转化对水稻生物学性状的影响

通过PCR方法从水稻“矮子占”和“南特号”的基因组DNA中分离出赤霉素20-氧化酶基因rga5,其编码区含1119 bp,其编码蛋白与已报道的水稻赤霉素20-氧化酶基因OsGA20ox相比有11个氨基酸不同,其中9个氨基酸为移码差异,通过基因枪法将该基因的正、反义表达质粒pSrga5和pArga5转化水稻“中花8号”,获得了生物学性状有明显变异的转基因植株,正义转化表现出植株增高、叶片和穗变长、穗粒数增加等特征,但花期未受明显的影响;而反义植株表现出明显的“矮化”和“早花”,且出现植株细弱、叶色加深、叶片和穗变短等特征,转基因水稻的分析结果表明,rga5正、反义外源基因已分别整合到水稻基因组中,并有效表达;正义植株体内的GA1平均增加约50％,反义则降低至对照组的约10％.结果表明,rga5是水稻赤霉素合成代谢途径中起关键作用的赤霉素20-氧化酶基因,该序列中11个氨基酸的变异并不影响其功能,正义表达可增强体内GA的合成,促使植株生长,增加株高;反义转化则抑制了内源GA的合成及植株生长,导致植株明显的矮化.

高等植物赤霉素生物合成关键组分GA20-oxidase氧化酶基因的研究进展

GA-20氧化酶(GA-20 oxidase)是重要的GA生物合成和调控酶,直接催化生成有生物活性的GAs,是一种多功能酶,最显著的特点就是负反馈调节。GA20-氧化酶在植物发育和生理过程中起着重要的调控作用。综述了高等植物体内GA20氧化酶基因的克隆及表达调控研究及其对株高、纤维、开花、产量性状等影响,重点阐述了GA20氧化酶基因与激素、光周期、抗性等之间的相互作用,以便更好地揭示GA-20氧化酶信号网络系统及其作用机制。

西洋参赤霉素20-氧化酶基因的克隆与序列分析

目的对西洋参Panax quinquefolium种子休眠与萌发过程中赤霉素20-氧化酶(GA20ox)基因编码区进行克隆及生物信息学分析。方法根据西洋参种子转录组的注释信息,得到9条GA20ox相关序列,通过比对分析确定了GA20ox的转录本。采用q RT-PCR方法得到西洋参GA20ox(Pq GA20ox)的c DNA全长,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR方法检测Pq GA20ox基因在根、茎、叶和种子休眠不同时期的表达水平。结果生物信息学分析表明,Pq GA20ox基因全长1 092 bp,编码363个氨基酸残基,Pq GA20ox编码蛋白不含跨膜区,不含信号肽。q RT-PCR实验结果显示Pq GA20ox基因在形态休眠起始期和生理休眠起始期表达量高于其他时期。结论首次获得Pq GA20ox基因的编码区序列,为进一步研究西洋参种子解除休眠的分子机制奠定基础。

棉花赤霉素氧化酶同源基因GhGA20ox1在烟草中的功能表达(英文)

为研究棉花GA20-氧化酶同源基因GhGA20ox1的功能,将该基因转入本明烟(N.benthamiana)中进行超量表达。RT-PCR分析表明GhGA20ox1基因在转基因植株中得到了不同水平的表达。GhGA20ox1基因的超量表达促进了本明烟中的GA4+7合成,并导致赤霉素过量的表型出现。转基因本明烟的表型变化程度与GhGA20ox1基因的表达水平和GA4+7的含量一致。这些结果表明,GhGA20ox1基因编码一个有功能的GA20-氧化酶,能够在转基因烟草中促进活性GA(GA4+7)的合成。

花生赤霉素2-氧化酶基因的克隆和表达研究

赤霉素2-氧化酶(GA2ox)是赤霉素合成过程中起负调控作用的一种关键酶,催化有活性的赤霉素生成无活性的赤霉素。从花生荚果发育不同时期的转录组序列中筛选到GA2ox的基因片段,采用5'-RACE方法克隆了花生GA2ox基因的全长cDNA序列。序列分析表明,花生GA2ox蛋白氨基酸序列含有和其他植物同样保守的结构域。通过qRT-PCR技术对GA2ox基因在花生不同组织器官中的表达分析,发现所检测的10种组织中均有GA2ox的表达,其中成年叶片中表达最丰富,根、刚入土的果针次之。本研究结果为进一步分析该基因在花生生长发育过程中的作用提供了有用信息。

小桐子赤霉素20氧化酶的基因克隆及低温下表达分析

赤霉素20氧化酶是植物赤霉素生物合成的限速酶,决定有生物活性的GA1与GA4的合成量。基于先前获得的小桐子低温锻炼转录组数据,以小桐子幼苗的根为材料,采用RT-PCR技术克隆到小桐子赤霉素20氧化酶基因Jc GA20ox的c DNA序列(Gen Bank登录号KJ670150.1)。该c DNA全长1 307 bp,含有完整的开放阅读框(1 131 bp),编码376个氨基酸,分子量为43 k D,理论等电点为6.7。其推导蛋白属于2-ODD家族,包含2-酮戊二酸双加氧酶结构域(Fe2OG_OXY)。半定量RT-PCR表达分析显示,Jc GA20ox在小桐子各组织中都有表达,但表达水平具有组织特异性,在茎中表达量较高,且受低温诱导表达最显著,而在叶中表达量相对较低。

高等植物赤霉素3-β-双氧化酶基因研究进展

赤霉素3-β-双氧化酶(GA3ox)是赤霉素(GA)生物合成过程中的关键酶之一,直接作用于活性GA的生成,在植物的生长发育过程中发挥着重要作用。GA3ox已在拟南芥、烟草、高粱和杨树等多种植物中得到克隆,在植物个体的不同生长阶段、不同组织中GA3ox的表达量均存在着差异,这主要是由物种内在的遗传因素所决定的,同时环境因子和外源激素处理对GA3ox表达也有着显著的影响。通过对基因突变体的研究,揭示出GA3ox突变导致GA的生物合成受阻而间接影响植物的生长,导致植物茎秆、花、种子、果、根等部位性状的改变,包括植株矮化、结籽困难等。过量表达GA3ox基因促进GA的生成,诱导细胞的分裂与分化,促进根尖的径向伸长、种子萌发等。主要从GA3ox的基因克隆与表达模式及其功能效应两方面综述了其在高等植物中研究进展,通过对GA3ox在不同植物中的相关功能研究,探讨其在植物生长发育过程中的具体作用,以期为了解GA3ox对植物生长发育的调控机制提供参考,也有助于在生产实践中更好地利用GA3ox开展基因工程研究,定向培育植物新品种。

蒺藜苜蓿赤霉素氧化酶基因MtGA20ox的功能解析

GA20-氧化酶(GA20-oxidase,GA20ox)是赤霉素(gibberellic acid,GA)合成过程中的关键限速酶。为了对蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中GA20ox基因的功能进行研究,利用生物信息学的方法对蒺藜苜蓿和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的GA20ox家族成员进行氨基酸序列比对并构建系统进化树。结果表明,与拟南芥AtGA20ox高度同源的蒺藜苜蓿MtGA20ox有3个,分别为MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8,均含有保守的2OG-FeⅡ_Oxy结构域。进一步通过RT-PCR检测MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8在不同组织中的表达,结果显示它们的表达都具有组织特异性。同时,亚细胞定位结果表明MtGA20ox1、MtGA20ox7和MtGA20ox8蛋白定位于细胞核和细胞质。为了对MtGA20ox的功能进行深入解析,筛选获得了逆转座子Tnt1插入MtGA20ox7的2个突变体和插入MtGA20ox8的1个突变体,并分别对3个插入突变体进行表型观察和数据统计,发现其与野生型相比株高无明显变化,这可能是由于这3个MtGA20ox基因存在功能冗余。研究结果对深入研究苜蓿中GA20ox的功能以及进一步研究赤霉素对株高的调控具有一定的参考价值。

梨矮化砧木中矮1号GA20-氧化酶基因克隆与表达分析

中矮1号是中国农业科学院果树研究所选育的梨优良矮化砧木,为研究其矮化机理,利用RT-PCR结合RACE方法克隆了梨矮化砧木中矮1号的1个GA20-氧化酶基因,并对该基因及其氨基酸序列以及该基因在不同生长类型梨品种中不同时期新梢叶片中的表达进行了分析。结果表明,该基因全长1 179 bp,推导编码392个氨基酸,其编码的蛋白质具有GA20-氧化酶基因家族所具有的功能活性位点和特征保守单元,该基因与苹果GA20-氧化酶基因氨基酸序列一致性达91.58%,因此确定该基因为中矮1号GA20-氧化酶基因,将其命名为PcGA20ox1(Gen-Bank登录号为HQ833589)。PcGA20ox1基因在中矮1号、亲本锦香和对照早酥3个品种不同发育阶段新梢叶片中的表达强度均为中矮1号<锦香<早酥,与植株高矮表现一致,表明PcGA20ox1基因的表达强弱与植株高矮相关。

棉花GA 20-氧化酶基因转毛白杨的研究

以毛白杨为材料,研究了超量表达赤霉素合成酶基因(GA20-氧化酶基因)对毛白杨根、茎和叶的生长以及组织结构的影响,结果显示,表达GA20-氧化酶基因能显著提高毛白杨茎的生长,但是对根系的生长带来负面影响.同时,超量表达GA20-氧化酶基因促进了毛白杨茎木质部的生长,抑制了韧皮部和皮层的生长.研究结果表明GA20-氧化酶基因在毛白杨遗传改良中具有一定的应用价值.

赤霉素诱导甘蔗GA20-Oxidase基因实时荧光定量PCR分析

本研究以喷清水甘蔗幼茎作为对照(即未处理),经过赤霉素处理后6h、12h、24h和48h的甘蔗幼茎为处理,分别进行取样并提取RNA,反转录获得cDNA作模板,利用SYBR GreenⅠ成功构建了目的基因(GA20-oxidase)和内参基因(GAPDH)的标准品和标准曲线。结果表明:内参基因与目的基因的起始模板浓度与Ct之间呈良好线性关系,决定系数分别为r2=0.998、r2=0.995;溶解曲线均显单峰型,证明扩增的特异性比较好,可对基因表达进行相对定量。定量结果表明:目的基因未处理的表达量最大,赤霉素处理后表达量持续下降,在6h达到最低值,12h后逐渐上升,但到48h又明显下降,且所有处理的表达量均低于未处理,6h、12h、24h和48h比对照的表达量分别下降了24.75%、13.18%、10.23%和20.34%。本实验研究GA20-oxidase基因在赤霉素处理后的表达情况,为进一步克隆甘蔗GA20氧化酶基因全长序列、研究该基因在甘蔗节间伸长过程中的表达调控及甘蔗茎间伸长中的作用机理提供理论依据。

GA20-氧化酶基因转化豆科牧草百脉根的研究

以豆科植物百脉根子叶为转化受体,通过根癌农杆菌介导方法将外源目的基因GA20-氧化酶(GA20-oxidase)和NPTII基因导入,经筛选分化、再生,得到具有卡那霉素抗性的转基因植物。在卡那霉素筛选浓度的选择中,25mg/L是百脉根较为适宜的筛选浓度。头孢霉素对农杆菌的抑制作用好于羧卞霉素。转基因植物移栽大田后生长良好。PCR检测证明外源目的基因已整合到百脉根基因组中。

PttGA20-氧化酶基因dsRNA抑止载体的构建

[目的]通过基因工程手段抑止赤霉素调控基因PttGA20-氧化酶基因的表达,从而抑制植物高生长和节间伸长,达到培育矮化植株的目的。[方法]依据RNAi原理,设计引物扩增正义及反义PttGA20ox片段插入pBI121载体CaMV35S启动子下游区域,并在正义和反义片段间隔区插入茎环结构GUS基因片段,将npⅡt标记基因替换为抗除草剂基因bar,构建dsRNA抑止载体。[结果]所构建的抑止载体经经不同内切酶酶切鉴定后均可释放出与目的条带大小相同片段,表明已成功构建PttGA20-氧化酶基因dsRNA抑止载体。[结论]该研究为培育矮化植株提供了新的途径。

梨品种中矮1号GA20-氧化酶基因正义和反义表达载体的构建

通过对已获得的中矮1号GA20-氧化酶基因的cDNA序列全长进行分析,选取Spe I/Bst EⅡ双酶切位点、以pCAMBIA1305为载体构建质粒。成功构建了GA20-氧化酶基因的植物正义和反义表达载体pCAMBIA1305-GAF和pCAMBIA1305-GAR,并成功转入到了农杆菌EHA105菌株中;为GA20-氧化酶基因的遗传转化和梨品种中矮1号矮化机理研究奠定了基础。

山核桃赤霉素氧化酶基因CcGA3ox的克隆和功能分析

【目的】赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases,GA3ox)是赤霉素(GAs)生物合成途径中关键酶之一,对山核桃(Carya cathayensis)中CcGA3ox基因进行克隆,并进行序列分析和功能验证。【方法】以山核桃体细胞胚为材料,提取RNA,采用PCR扩增技术,克隆山核桃CcGA3ox基因编码区全长;对序列进行生物信息学分析。为验证基因功能,通过同源重组技术构建具有强启动子的35S::CcGA3ox::GFP过表达载体,以核桃体细胞胚为转化材料,利用农杆菌介导法进行遗传转化;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析山核桃CcGA3ox基因在转基因阳性核桃植株中的相对表达量。采用紫外分光光度计检测植株中叶绿素含量,并分析其差异。【结果】山核桃CcGA3ox基因开放阅读框(ORF)全长为1 116 bp,编码371个氨基酸。对CcGA3ox氨基酸序列分析发现,其含有2OG-FeⅡ-Oxy结构域。系统进化树显示,CcGA3ox与薄壳山核桃CiGA3ox亲缘关系最近,与核桃JrGA3ox亲缘关系较近。对核桃体细胞胚进行遗传转化、荧光检测及PCR验证表明,35S::CcGA3ox::GFP过表达载体被成功转入核桃体胚中。核桃阳性再生植株与对照植株相比,株高明显增高;qRT-PCR结果表明,CcGA3ox基因相对表达量显著增加。同时,过表达CcGA3ox基因可以降低核桃阳性再生植株中叶绿素含量。【结论】山核桃CcGA3ox基因在核桃生长过程中对株高调控起关键作用。

干扰烟草GA 20-氧化酶siRNA植物表达载体的构建及矮化烟草的产生

根据烟草(Nicotiana tabacum)GA 20-氧化酶基因序列,设计2对分别含有特定酶切位点的特异引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增目的基因(约250bp)片段.将正、反向目的片段分别插入中间载体的内含子两侧,再经BamHI和SacI双酶切回收约700bp的目的片段,插入到双元载体质粒p2355中,成功构建了含GA20-氧化酶基因片段的反向重复序列植物表达载体p23700,其转录产物能形成发夹RNA(hpRNA),产生小分子干扰RNA,干扰目的基因的表达.将p23700质粒导入根癌农杆菌EHA105中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得表型矮化的转基因烟草.

小叶杨GA20氧化酶基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次从小叶杨未成熟木质部cDNA中分离出PsGA20OxcDNA全长及其基因组DNA,并进行测序和序列分析。结果表明:克隆的小叶杨PsGA20OxcDNA片段总长为1403bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1155bp,编码区可编码长度为385个AA残基,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥和水稻GA20Ox蛋白的同源性分别为66.0%和57.0%。组织特异性RT-PCR结果显示,PsGA20Ox基因在杨树茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PsGA20Ox在成熟木质部中表达丰度最高,在未成熟木质部和嫩叶中表达丰度较高,在顶端分生组织中有少量表达,在形成层组织中表达丰度极低。在此基础上,组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对小叶杨36株基因型个体的PsGA20Ox基因组DNA序列进行比对和分析,检测到49个单核苷酸多态性(SNP)位点,频率为1/35bp。其中,15个是常见SNPs,34个为罕见SNPs。在这些SNPs中,37个属于转换,12个属于颠换。在外显子区域,共检测到26个SNP位点,其中23个为同义突变,3个为错义突变。对PsGA20Ox基因内SNPs进行的连锁不平衡分析表明,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部就迅速衰退,因此,在小叶杨中,基于候选基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的,也是不必要的。

高等植物GA 20-氧化酶研究进展

GA 20-氧化酶(GA 20-oxidase)是高等植物体内GA生物合成途径中最重要的限速酶,它能够催化从GA12到GA9及GA53到GA20一系列的氧化反应。作者对近年来有关GA 20-氧化酶的特征、GA 20-氧化酶基因及编码蛋白、GA 20-氧化酶基因表达调控进行了综合评述,并对GA20-氧化酶基因转化在农业、林业、园艺业方面的应用前景进行了展望。