山核桃赤霉素氧化酶基因CcGA3ox的克隆和功能分析

【目的】赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases,GA3ox)是赤霉素(GAs)生物合成途径中关键酶之一,对山核桃(Carya cathayensis)中CcGA3ox基因进行克隆,并进行序列分析和功能验证。【方法】以山核桃体细胞胚为材料,提取RNA,采用PCR扩增技术,克隆山核桃CcGA3ox基因编码区全长;对序列进行生物信息学分析。为验证基因功能,通过同源重组技术构建具有强启动子的35S::CcGA3ox::GFP过表达载体,以核桃体细胞胚为转化材料,利用农杆菌介导法进行遗传转化;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析山核桃CcGA3ox基因在转基因阳性核桃植株中的相对表达量。采用紫外分光光度计检测植株中叶绿素含量,并分析其差异。【结果】山核桃CcGA3ox基因开放阅读框(ORF)全长为1 116 bp,编码371个氨基酸。对CcGA3ox氨基酸序列分析发现,其含有2OG-FeⅡ-Oxy结构域。系统进化树显示,CcGA3ox与薄壳山核桃CiGA3ox亲缘关系最近,与核桃JrGA3ox亲缘关系较近。对核桃体细胞胚进行遗传转化、荧光检测及PCR验证表明,35S::CcGA3ox::GFP过表达载体被成功转入核桃体胚中。核桃阳性再生植株与对照植株相比,株高明显增高;qRT-PCR结果表明,CcGA3ox基因相对表达量显著增加。同时,过表达CcGA3ox基因可以降低核桃阳性再生植株中叶绿素含量。【结论】山核桃CcGA3ox基因在核桃生长过程中对株高调控起关键作用。

高等植物赤霉素3-β-双氧化酶基因研究进展

赤霉素3-β-双氧化酶(GA3ox)是赤霉素(GA)生物合成过程中的关键酶之一,直接作用于活性GA的生成,在植物的生长发育过程中发挥着重要作用。GA3ox已在拟南芥、烟草、高粱和杨树等多种植物中得到克隆,在植物个体的不同生长阶段、不同组织中GA3ox的表达量均存在着差异,这主要是由物种内在的遗传因素所决定的,同时环境因子和外源激素处理对GA3ox表达也有着显著的影响。通过对基因突变体的研究,揭示出GA3ox突变导致GA的生物合成受阻而间接影响植物的生长,导致植物茎秆、花、种子、果、根等部位性状的改变,包括植株矮化、结籽困难等。过量表达GA3ox基因促进GA的生成,诱导细胞的分裂与分化,促进根尖的径向伸长、种子萌发等。主要从GA3ox的基因克隆与表达模式及其功能效应两方面综述了其在高等植物中研究进展,通过对GA3ox在不同植物中的相关功能研究,探讨其在植物生长发育过程中的具体作用,以期为了解GA3ox对植物生长发育的调控机制提供参考,也有助于在生产实践中更好地利用GA3ox开展基因工程研究,定向培育植物新品种。

草莓中贝壳杉烯氧化酶基因(STGA3)中两个不同编码序列的克隆

以保守氨基酸序列设计了简并性引物的方法,克隆‘丰香’草莓(Fragaria gradiflora‘Fengxiang’)贝壳杉烯氧化酶基因部分序列,发现叶片和花蕾中合成赤霉素的贝壳杉烯氧化酶的序列不同,Southern杂交方法检测在草莓基因组中存在3个拷贝的目标基因,表明在草莓中至少有两个不同基因共同编码贝壳杉烯氧化酶,以响应不同发育信号的调控。

广藿香PcGA2ox1基因克隆、VIGS载体构建和表达分析

赤霉素2-氧化酶(gibberellin 2-oxidases,GA2ox)是赤霉素(GAs)代谢途径关键酶,调节活性GAs降解,在植物株型调控中发挥重要作用。为探寻GA2ox基因在广藿香中的功能,本研究对广藿香PcGA2ox1基因进行克隆,得到561 bp的CDS序列。生物信息学分析结果表明,PcGA2ox1蛋白编码186个氨基酸,为亲水性蛋白,分子量为20.98 kDa,等电点为5.81,不含信号肽,无跨膜结构域,具有GA2ox超基因家族的保守结构域,主要定位在细胞核。系统发育分析结果显示,PcGA2ox1基因与丹参GA2ox7的亲缘关系最为密切。qRT-PCR结果显示,PcGA2ox1基因在广藿香中的表达具有组织特异性,叶中表达量最高,根中表达量最低。用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术侵染广藿香的结果显示,侵染两周后,PcGA2ox1基因表达量比阴性对照下降83%,比空白对照下降71%,沉默效果明显。本研究结果可为深入了解PcGA2ox1结构、功能和作用机理奠定基础,并为广藿香优良品种选育提供参考。

矮化香蕉及其野生型GA3ox基因的结构特点和表达分析

香蕉的矮化突变是香蕉无性繁殖后代最常见的表型变异之一,但其变异的分子调控机理目前尚未研究清楚;而内源赤霉素是影响植物株高的重要激素之一,GA3-氧化酶是赤霉素生物合成后期的关键酶。为探究GA3-氧化酶编码基因对香蕉矮化的分子调控机理,该研究以威廉斯B6矮化突变体及其野生型亲本为材料,通过RT-PCR技术克隆得到矮化香蕉及其野生型亲本GA 3 ox基因的全长cDNA序列,并对其推测的氨基酸序列进行比对分析,同时利用qRT-PCR技术对GA 3 ox基因在不同组织中的表达水平差异进行分析。结果表明:(1)矮化香蕉GA 3 ox-A和野生型香蕉GA 3 ox-G的ORF长度均为864 bp,均编码287个氨基酸,经序列比对分析发现两条氨基酸序列之间存在5个位点的差异,从而产生具有不同性质的蛋白质。(2)氨基酸序列同源性分析表明,矮化香蕉GA3ox的氨基酸序列与油棕、海枣、椰子的同源性最高。(3)qRT-PCR显示,GA 3 ox基因在矮化香蕉叶片和茎秆中的表达水平整体上低于野生型,其中GA 3 ox在野生型茎秆中的表达水平是矮化植株的2.2~32倍。综上推测,GA 3 ox基因可能对香蕉茎杆的矮化变异具有重要的调控作用。该研究结果为揭示香蕉矮化突变的分子机制与筛选优良矮化香蕉株系奠定了基础。

基于转录组测序技术探究GA_3和CPPU抑制葡萄果锈产生的机理

为探究GA_3(赤霉素)和CPPU[N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲]抑制葡萄果锈生成的内在机理,以阳光玫瑰葡萄为试验材料,在盛花期用25 mg/L GA_3处理花穗,花后2周用25 mg/L GA_3+10 mg/L CPPU再次处理花穗,以清水处理作为对照,取果锈生成关键期的2个葡萄果皮样品,应用Illumina RNA-Seq测序系统进行转录组分析。共获得55 314 986条有效数据和2 373个差异基因,GO功能注释到细胞组分、分子功能及生物学过程3个大类30个功能组,大量基因富集于碳水化合物代谢、生物合成等生物学过程。KEGG代谢通路分析结果显示将1 186个差异表达基因注释到126条代谢通路,富集于"代谢途径"与"苯丙烷合成"代谢通路。通过qRT-PCR方法对筛选的9个差异表达基因进行验证,荧光定量结果与测序结果相符。研究结果说明GA_3和CPPU处理减少葡萄果锈的产生主要与苯丙烷合成及类黄酮代谢相关,GA_3和CPPU显著抑制苯丙烷及类黄酮合成相关基因表达,进而降低了果锈生成路径中相关酶的活性,减少了果锈生成相关次生代谢物的产生,抑制葡萄果锈的生成。

水稻赤霉素3β羟化酶基因(OsGA3ox1)同源基因的生物信息学分析

赤霉素3β-双氧化酶(GA3ox)是赤霉素(GA)生物合成过程中的关键酶,它通过催化活性GA的形成来影响植物生长发育。为了了解水稻GA3ox家族成员的基本情况,本研究利用生物信息学方法对其家族成员进行了预测、蛋白结构及其聚类分析。结果表明:第一,以OsGA3ox1 (LOC_Os05g08540)作为靶序列,利用BlastP在gramene数据库中共查询到了24个同源基因,同源性为80%～90%;第二,经NCBI在线分析发现,各同源基因的蛋白产物都含有2OG-FeII_Oxy和DIOX_N两个保守结构域,其结构域中都具有与Fe^(2+)结合的2个组氨酸残基(H)和1个天冬氨酸残基(D)以及能结合α-酮戊二酸的1个精氨酸残基(R)和1个丝氨酸残基(S),并且还观察到这些蛋白间具有相同或相似的α-螺旋和β-转角等二级结构,因此,推测它们同属于GA3ox家族;第三,进一步地,利用MEGA7.0构建了该家族的系统进化树,并将该家族分成ClassⅠ和ClassⅡ两个亚族,各亚族分别包括了16个和8个成员。本研究结果为深入研究水稻OsGA3ox基因的生物学功能提供参考依据。