西罗莫司对大鼠血管平滑肌细胞增殖、起始识别复合物1表达的影响及机制探讨

目的探讨西罗莫司对体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、起始识别复合物1(ORC1)表达的影响及机制。方法细胞随机分为对照组和实验组,每组3瓶/孔,血清饥饿法培养细胞24h使其同步化。对照组采用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养,实验组采用含10μmol/L西罗莫司+10%胎牛血清的DMEM培养液培养。继续培养0～48h,采用免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达,电子显微镜观察细胞超微结构,RT-PCR法检测ORC1mRNA的表达,蛋白质印迹法检测P53、cyclin D1、cyclin A和ORC1蛋白的表达。结果与对照组相比,实验组48hPCNA阳性表达率降低[(20±2.1)%vs(80±3.0)%,P<0.05],P53蛋白表达升高(P<0.05);细胞核有固缩的迹象;实验组cyclin D1蛋白表达轻微升高(P>0.05),48hcyclin A蛋白的表达下降(P<0.05)。对照组ORC1mRNA的表达在0～12h升高,24～48h降低,高峰期在12h。实验组细胞ORC1mRNA的表达始终处于高水平。与同时间对照组比较,实验组48hORC1mRNA的表达升高(P<0.05)。蛋白质印迹分析结果与之相似。结论西罗莫司抑制VSMCs增殖,同时促进其凋亡;其作用环节可能是通过阻止细胞由G0/G1期向S期转化,诱导细胞处于静止状态;ORC1的作用环节位于西罗莫司作用点的上游,进一步支持ORC1参与细胞复制起始过程。

起始识别复合物1对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的起始识别复合物1(origin recognition complex1,ORC1)与血管平滑肌细胞增殖密切相关[1],文中探讨ORC1对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖活性的影响。方法用组织块贴片法培养大鼠胸主动脉VSMC;用流式细胞术测定VSMC静止期和增殖期的细胞周期,并计算出不同状态的增殖活性;用免疫荧光法测定ORC1在VSMC中的表达位置,用流式细胞术测定不同细胞周期中ORC1蛋白表达。结果静止期VSMC的增殖活性很低[(10.40±3.52)%],在VSMC中ORC1不表达或低水平表达。血清剌激24 h后,处于增殖期的VSMC的增殖活性明显增加,达(33.91±13.42)%,ORC1蛋白表达也明显增加(P<0.01)。结论 ORC1可能与VSMC增殖活性有关。

起始识别复合物结合位点对沉默子的辅助作用

背景:沉默子由起始识别复合物结合位点,阻遏活化蛋白RAP1等元件组成,人们对于沉默子的功能及相互关系有较多研究,但对组成沉默子的元件与基因沉默之间关系的研究很少。目的:研究起始识别复合物结合位点对沉默子基因沉默的辅助作用。方法:用右侧带有报告基因URA3的起始识别复合物结合位点,以及不带任何结合位点的序列替代酵母基因组HML区域的HML-I沉默子后,比较URA3基因表达量,并使用DNA拓扑法分析染色质的结构变化。结果与结论:HML-E沉默子单独存在的情况下,酵母无法在FOA平板上生长,但在起始识别复合物结合位点的辅助下,能够在FOA平板上生长,两者之间区域的染色质大多为负超螺旋。因此可知起始识别复合物结合位点能增加HML-E沉默子作用范围,产生这种作用的原因是两者相互作用下形成紧密的染色质结构。

细胞周期蛋白A对培养大鼠血管平滑肌细胞起始识别复合物1表达水平的影响

目的 探讨细胞周期蛋白A （Cyclin A）对培养大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）周期起始识别复合物1（ORC1）表达水平的影响.方法 采用组织块贴片法原代培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,利用双胸苷使VSMCs达到细胞周期同步化,应用逆转录聚合酶链反应技术和流式细胞仪检测不同细胞周期VSMCs的ORC1和Cyclin A mRNA和蛋白表达.结果 经鉴定培养的细胞为VSMCs,采用血清饥饿法、双胸苷阻断法和秋水仙素阻抑法分别获得了处于不同细胞周期的同步化的VSMCs：G0/G1期（89.22 ±3.54）％,G1/S交界期（66.74±7.16）％,S期（63.24±4.06）％,G2/M期（51.64±11.18）％,各期比较差异有统计学意义（P均＜0.01）.Cyclin A在静止状态对VSMCs的ORC1 mRNA和蛋白无影响,在G2/M期达到高峰[（52.133 3 ±2.122 1）％],与G1/S期[（10.9167±0.531 1）％]、S期[（7.656 7±0.412 4）％]比较,差异有统计学意义（P均＜0.01）.ORC1在G2/M期达到最低值[（1.276 7 ±0.161 7）％],与G1/S期[（13.371 0±1.057 3）％]、S期[（3.043 3 ±0.538 0）％]比较,差异有统计学意义（P均＜0.01）,可能原因是Cyclin A阻止ORC1结合在VSMCs染色质上.结论 CyclinA可能调控ORC1在VSMCs细胞周期的启动.

微小RNA-610对血小板源生长因子诱导的血管平滑肌细胞影响的分子机制研究

目的探讨微小RNA-610(miR-610)对血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法双荧光素酶报告基因分析法验证miR-610对起始识别复合物1(ORC1)的靶向作用。将VSMCs分为8组:空白组、实验组(PDGF-BB处理)和第1至第6转染组(分别转染miR-NC、miR-610模拟物、si-NC、si-ORC1、miR-610+pcDNA、miR-610+pcDNA-ORC1后,进行PDGF-BB处理)。用噻唑蓝法、Transwell实验分别检测细胞活性和迁移、侵袭能力。结果miR-610靶向负性调控ORC1表达。空白组、实验组、第1转染组至第6转染组细胞活力(48 h)分别为0.41±0.04,0.64±0.07,0.72±0.07,0.48±0.05,0.65±0.06,0.48±0.05,0.45±0.05和0.64±0.06;这8组的迁移细胞数分别为(38.46±6.38),(86.39±8.16),(89.34±8.25),(52.39±5.11),(86.73±8.23),(59.63±5.25),(47.89±4.25)和(71.46±7.03)个;这8组的侵袭细胞数分别为(29.36±5.67),(78.69±7.26),(81.43±8.18),(41.59±6.28),(75.36±7.29),(48.63±4.27),(35.41±5.74)和(62.43±6.52)个。空白组与实验组比较,或第1转染组与第2转染组比较,或第3转染组与第4转染组比较,或第5转染组与第6转染组比较,上述指标的差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论miR-610通过下调ORC1抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的增殖、迁移和侵袭。