HCN4基因修饰大鼠MSCs体外诱导获得的心脏起搏样细胞动作电位检测

目的探讨超极化激活及环化核苷酸调控的阳离子通道亚型4(hyperpolarization-activated cyclic nucleotidegated cation channel4,HCN4)基因修饰大鼠MSCs体外诱导分化的心脏起搏样细胞的动作电位特性。方法以HCN4基因修饰大鼠MSCs体外诱导获得的具有自发搏动的心脏起搏样细胞为实验组,同期培养的原代乳鼠窦房结细胞为对照组,采用全细胞膜片钳技术对两组细胞的动作电位进行检测。结果心脏起搏样细胞及原代培养乳鼠窦房结细胞均可记录到具有舒张期自动去极化的动作电位,心脏起搏样细胞的动作电位特性与原代培养的乳鼠窦房结细胞相比,其静息电位、动作电位幅度及动作电位周期均无显著性差异(P>0.05),但阈电位较原代培养的乳窦鼠房结细胞显著降低(P<0.01)。结论从电生理角度证实,心脏起搏样细胞的特性与原代培养的乳鼠窦房结细胞相似。

hHCN2基因转染的脂肪组织来源的成体干细胞可分化为起搏样细胞

目的大鼠脂肪来源的成体干细胞(ADSC)转染人超极化激活环核苷酸门控离子通道-2(hHCN2)基因,观察其作为起搏细胞的可行性。方法取生长良好的ADSC转染hHCN2基因,通过RT-PCR、Western blot分析、免疫荧光技术检测hHCN2基因及蛋白的表达,用膜片钳技术检测细胞的电生理特征并记录其内向电流。将转染hHCN2基因的ADSC与心室肌细胞共培养,观察其对心室肌细胞自发性搏动的影响。结果 hHCN2基因修饰的大鼠ADSC能表达较强的hHCN2基因及蛋白,还能够产生超级化激活内向离子流。将其与心室肌细胞共培养,能使心室肌细胞的自发性搏动明显增快增强。结论将hHCN2基因转染ADSC能够使其分化为具有起搏功能的起搏样细胞,为进一步优化生物起搏器的研究提供了材料。

体外诱导小鼠骨髓CD45-细胞向窦房结起搏样细胞定向分化

目的探讨体外诱导小鼠骨髓CD45-细胞向窦房结起搏样细胞定向分化的方法。方法免疫磁珠分选小鼠骨髓CD45-细胞,体外培养扩增后,采用添加了5-氮胞苷和小鼠窦房结组织培养上清液的诱导培养基培养,经免疫荧光染色检测起搏样细胞标志物神经丝蛋白-160(NF-160)和超级化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)4表达,并采用q RT-PCR定量检测起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表达。结果小鼠骨髓CD45-细胞经体外诱导培养后得到的分化细胞表达NF-160和HCN4;q RT-PCR分析显示,与体外培养的小鼠窦房结细胞比较,分化起搏样细胞NF-160和HCN4的表达升高,HCN2的表达降低。结论体外培养能够将小鼠骨髓CD45-细胞诱导分化为窦房结起搏样细胞,为构建生物起搏器种子细胞提供选择。

阻断经典Wnt通路对棕色脂肪干细胞向起搏样细胞分化的作用

目的：研究阻断经典Wnt通路对棕色脂肪干细胞向起搏样细胞分化的影响.方法：在诱导棕色脂肪干细胞向起搏特性诱导的过程中,培养基中加入经典Wnt通路阻断剂Dkk-1培养10 d.相差显微镜观察诱导组细胞的形态学变化、应用real-time PCR检测其中起搏细胞发育相关结构基因的表达情况,免疫荧光显色普通光镜和激光共聚焦显微镜观察起搏特征分子的蛋白表达.结果：分化后的棕色脂肪干细胞具有起搏细胞特性,经Dkk-1诱导后,棕色脂肪干细胞向起搏样细胞的转化率明显提高,起搏细胞发育相关基因和蛋白表达明显上调.结论：阻断经典Wnt通路可促进棕色脂肪干细胞向起搏样细胞的分化.

ISL-1诱导脂肪干细胞向起搏样细胞分化

目的探讨过表达胰岛素基因增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein 1,ISL-1)的慢病毒在体外转染脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),能否诱导ADSCs向起搏样细胞分化。方法取第3～5代ADSCs,随机分成Bank、m Cherry和胰岛素基因增强子结合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein 1,ISL-1) 3组,按分组分别转染病毒,经荧光强度和流式分析确定最适感染复数,与乳鼠心室肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRVMs)共培养7天后进行实时荧光定量聚合酶式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、蛋白质印迹、免疫荧光检测分析,期间观察细胞形态和搏动频率变化,并用膜片钳技术记录细胞内电流活动。结果分离贴壁后的ADSCs呈长梭形,慢病毒转染ADSCs的最适感染复数为50。ISL-1组ADSCs形态呈多样化,窦房结特异性基因HCN4、Cx45和Tbx3的mRNA表达水平上调,而工作心肌特异性基因Nkx2. 5下调,组间比较差异有统计学意义(P <0. 05)。ISL-1组大多数细胞可检测到HCN4表达并且可记录到超极化内向电流。结论经ISL-1基因修饰的ADSCs通过体外心肌微环境诱导,产生了一定的高表达窦房结标志性基因并具有细胞内典型超极化电活动的起搏样细胞。

干细胞与生物起搏的研究进展

综述干细胞与生物起搏相关的研究进展。“心脏生物起搏”已成为探究缓慢性心律失常治疗的新方向。心脏生物起搏是指利用细胞分子生物学及其相关技术,对机体受损的自律性节律点或特殊传导系统的细胞进行修复或替代,从而构建“生物起搏器”,得以恢复心脏的起搏和传导功能,并从心脏生理功能和人体适应性的角度,避免了传统电子起搏器的缺陷和严重并发症,是迈向基于自体干细胞更理想的疗法。