超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B亚单位防治大鼠高危角膜移植免疫排斥反应的研究

目的探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B亚单位(SEB)对大鼠高危角膜移植免疫排斥反应的防治作用机制。方法实验供体为30只Fisher344和4只Lewis大鼠,受体为64只Lewis大鼠。将实验受体大鼠按随机数字表法随机分为4个治疗组和1个对照组,每组12只;同时设4只Lewis大鼠行同种同体移植。治疗组术前分别用02ml不同浓度的SEB(25、50、75、100μg/kg)腹腔注射诱导免疫耐受。对照组用02ml生理盐水腹腔注射。缝线法诱导受体角膜新生血管,然后行穿透性角膜移植术,术后观察记录植片的存活状况并对受体全身免疫状态进行免疫组化染色,流式细胞分析和淋巴细胞增殖能力检测。结果对照组大鼠角膜植片的平均存活时间为(730±067)d,SEB治疗组(25、50、75、100μg/kg)植片存活时间分别为(643±127)d、(1070±250)d、(1250±141)d、(883±194)d。免疫组织化学染色和流式细胞检测显示SEB治疗组大鼠角膜植片中淋巴细胞的浸润以及外周免疫器官中淋巴细胞亚群百分数较对照组明显降低。此外,SEB治疗组中受体淋巴细胞对供体抗原刺激的反应性降低,外周血中白细胞介素(IL)2浓度降低而IL10浓度升高,其中以SEB75μg/kg组作用最明显。结论在一定剂量范围内,SEB可以诱导大鼠免疫耐受形成,减少局部和全身淋巴细胞数量。

基于荧光生物传感技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B

目的利用纳米金粒子(gold nanoparticles,AuNPs)荧光猝灭性能和核酸适配体的高亲和力,构建一种简便、灵敏的纳米金“Turn-on”型荧光生物传感方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxins B,SEB)的方法。方法以AuNPs作为荧光体的能量受体(猝灭剂),荧光素-单链DNA(fluorescein-ssDNA,FAM-ssDNA)作为荧光能量供体,冷冻法制备AuNPs-SEB适配体复合物,基于AuNPsSEB适配体复合物/SEB/FAM-ssDNA的竞争性结合,构建纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测方法。对缓冲体系pH和反应时间等条件进行优化,以牛奶为代表对方法检测性能进行验证。结果在优化好的实验条件(pH 7.5、反应时间15 min和反应温度25℃)下,在10^(-1)~10^(4)ng/mL范围内,荧光强度与SEB质量浓度之间呈现良好的线性关系,其相关系数为0.995,检出限为0.062 ng/mL。应用于牛奶样品中SEB的测定,方法回收率为91.2%~108.0%,相对标准偏差在2.6%~5.2%范围之间。结论该纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测技术具有简便、灵敏和准确等优点,可为食品中污染物的检测提供一种可行的新方法。

牛乳金黄色葡萄球菌分离株超抗原肠毒素基因分型研究

为研究牛乳金黄色葡萄球菌SP-3分离株携带超抗原肠毒素的基因型,设计合成了金黄色葡萄球菌超抗原肠毒素基因SEA-SEE及TSST-1特异性引物,并以其固有基因femA和femB为阳性对照,以分离菌株DNA为模板,经PCR扩增菌株携带的毒素基因。结果表明,SP-3分离株和阳性对照菌株均含有femA和femB基因,且牛乳分离株携带sea、sec、sed和tst-1 4种超抗原肠毒素基因,为开展动物源超抗原毒素基因系统分型及有效防控金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎奠定基础。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对人外周血T细胞活化作用的观察

目的 观察超抗原对外周血T细胞的活化作用。方法 用不同浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激人外周血T细胞,观察细胞增殖、IL-2的产生及细胞表型情况。结果 当SEA为1μg/ml时,T细胞表现了最大的增殖活性;SEA对CD4+、CD8+T细胞有同等活化作用;IL-2在培养后的48～72,小时产生的量最大。结论 SEA对外周血T细胞有明显的促增殖作用。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对T淋巴细胞分化的作用

目的:探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(stapylococoal enterotoxin A,SEA)对T淋巴细胞亚群Tc/Th细胞增殖的不同影响。方法:以SEA刺激脐带血单个核细胞(CBMCs),以3H-TdR掺入法及ELISA法检测Tc/Th细胞对SEA刺激的反应。结果:经SEA刺激后,CBMCs中的Tc0/Th0增殖并向Ⅰ型或Ⅱ型分化。在较低浓度SEA刺激时,CBMCs分泌IL-10的比例高于γ-IFN;而经较高浓度SEA刺激后,CBMC分泌γ-IFN的比例高于IL-10。结论:SEA在较低浓度刺激时,诱导T淋巴细胞向Tc1/Th1的分化;而较高浓度时,在促进T细胞增殖的同时,可以诱导T细胞向Tc2/Th2的分化。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素对荷瘤大鼠胃癌模型炎性介质影响的研究

目的 研究超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 (SEA)对荷瘤大鼠胃癌模型炎性介质影响。方法 采用人胃癌细胞 (MGC80 -3 )皮下接种建立大鼠胃癌模型 40只 ,实验组注射SEA ,对照组注射生理盐水 ,检测大鼠体内炎性介质水平。结果 荷瘤大鼠模型SEA处理以后 ,血清IL 1β ,IL 6,IL 12 ,TNF α和内毒素水平均明显上升 ,与对照组相比差异有显著性 ,尤其以血清IL 1β内毒素水平上升明显 (P <0 .0 1)。结论 超抗原SEA可激活大量的T细胞 ,分泌多种细胞因子 ,直接或间接地杀伤肿瘤细胞。

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约 70 0bp的DNA片段 ,将之克隆到pGEM 7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因 ,它含有 717bp(不包括N端81bp的信号肽编码区 ) ,其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体 7ZTS上 ,转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)内。表达的SEB占总蛋白 33.5 %。

PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因

目的 :金黄色葡萄球菌B型肠毒素是污染食品引起食物中毒的主要原因之一 ,针对进出口食品卫生监测的需要 ,研究一种简便、快速、准确的实验方法。方法 :利用聚合酶链反应技术 (PCR)采用特异的模板探针引物进行杂交 ,最后通过电泳技术与阳性对照进行比对 ,来判断阴阳性结果。结果 :本方法检出率高 ,每克样品中有 4个金黄色葡萄球菌即可检出 ,2 4小时即可报告结果。结论 :PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因快速、准确 ,检测周期短 ,既可提高检出率 ,又可节省检测时间。

重组葡萄球菌B型肠毒素超抗原的制备及抗肿瘤活性分析

目的 采用基因工程技术制备葡萄球菌B型肠毒素 (SEB) ,并对其体内外抗肿瘤活性进行分析。方法 对SEB在大肠杆菌中进行高效表达和分离纯化 ,并对其超抗原活性和免疫学活性与天然SEB进行比较研究。观察重组SEB对人肝癌细胞的体外抑制作用 ,以及对小鼠肝癌和肉瘤的体内抑瘤效果。结果 SEB获得高效表达 ,并一步将其纯化至均质。与天然毒素相比较 ,重组SEB的免疫学活性与超抗原活性基本相似。首次证明 ,即使SEB的浓度为 10ng/L ,仍然对人肝癌细胞有显著地抑制作用 ,其对小鼠体内的肝癌和肉瘤有一定的抑制作用。结论 重组SEB在体内外均有一定肿瘤抑制作用 。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素的培养产毒与柱层析纯化

本文采用玻璃纸覆盖琼脂平板法,在37℃培养金黄色葡萄球菌48h后,收集菌体,10000×g离心15min,上清液经聚乙二醇20000浓缩。浓缩液依次经羧甲基阳离子交换纤维素CM-32层析和葡聚糖凝胶SephadexG-75过滤纯化,获得电泳纯的金黄色葡萄球菌B型肠毒素。实验证明,利用该简化的二步柱层析分离得到的金黄色葡萄球菌B型肠毒素完全能满足血清学检实验和鉴定的要求,方法简便易行,一般实验室均可使用。

金黄色葡萄球菌肠毒素B对豚鼠哮喘模型Th1/Th2细胞因子的影响

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B,SEB)对豚鼠支气管哮喘(简称哮喘)模型气道炎症及Th1/Th2细胞因子的影响。方法27只豚鼠随机分为对照组,模型组,SEB组各9只,用卵白蛋白(OVA)建立哮喘模型。末次激发豚鼠24-48 h内处理,支气管肺泡灌洗,直接记数总白细胞和嗜酸性粒细胞,观察肺组织病理改变,分装冻存支气管肺泡灌洗液做细胞因子检测。结果SEB组豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量为(2.6±0.64)×106,显著低于模型组的(13.0±1.8)×106(P<0.01);肺组织哮喘炎症反应也轻于模型组;SEB组肺泡灌洗液中Th1细胞因子IFNγ-浓度(126.41±5.17)pg/mL,高于模型组(86.52±5.10)pg/mL(P<0.05);而Th2细胞因子IL-4浓度(50.02±2.79)pg/mL低于模型组(78.30±3.88)pg/mL(P<0.05)。结论SEB能减少哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量,可以通过调节Th1/Th2细胞因子的比值来减轻气道哮喘炎症反应。

金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆与表达

目的克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,表达并纯化基因重组SEB,并对其进行活性研究。方法采用PCR技术从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增得到SEB基因,克隆到原核表达载体pET22b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,全自动测序仪测序。IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,用HiTrapTMchelating HP柱纯化重组表达的SEB,通过ELISA实验检验重组SEB的抗原性。用脂多糖和放线菌素D致敏小鼠模型检测重组SEB的毒性。结果所克隆的SEB基因核苷酸序列与报道的序列完全相同。表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符,得到了SDS-PAGE电泳纯的基因重组SEB。ELISA试验结果表明,纯化的重组SEB与抗野生型SEB单克隆抗体呈现明显的阳性免疫反应。小鼠致死性试验表明,重组SEB与野生型SEB具有相同的毒性。结论在大肠杆菌中成功克隆及表达了金黄色葡萄球菌肠毒素B,为进一步分析SEB分子中相关活性位点及研究SEB发病机制打下了基础。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对异位皮炎患者外周血单个核细胞活化作用的观察

目的观察超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对异位皮炎(AD)患者外周血单个核细胞(PBMC)的活化作用。方法用不同浓度的SEA刺激AD患者PBMC,MTT法观察PBMC增殖及流式细胞术检测T细胞表型情况。结果AD患者皮损表面金葡菌检出率为91.2%;当SEA为0.8μg/ml时PBMC表现了最大的增殖活性,健康志愿者SEA刺激后T细胞CD3、CD4、CD8表达显著降低,AD患者SEA刺激后T细胞CD3、CD4、CD8的表达显著增高,AD患者和健康志愿者SEA刺激前后CD4/CD8差异无显著性。结论AD患者皮损对金葡菌具有亲合性,SEA与AD发病有关。

乳品中金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫传感检测方法的研究

本文利用自制的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)抗体构建了一种L-半胱氨酸和纳米金的双层自组装免疫传感器,采用循环伏安法及交流阻抗法对传感器进行表征与测定,并对各项相关条件进行优化,最终建立了SEB检测的标准曲线,线性范围分别在2～10 ng/mL和10～100 ng/mL,相关系数分别为0.9939和0.9926,检出限(S/N=3)为0.667 ng/mL,乳品检测回收率在84.3%～93.2%之间。该传感器特异性良好,稳定性好,可再生使用,可应用于乳品中SEB的快速检测。

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。

金黄色葡萄球菌L型产B型肠毒素及其基因的研究

目的 :探讨金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )L型肠毒素B的产生量及其基因存在情况。方法 :将金葡菌诱导成稳定L型后 ,用ELISA法检测葡萄球菌肠毒素B(SEB) ,用PCR法检测SEB基因。结果 :金葡菌L型SEB的产生量与原菌比差别无显著性 (P >0 .0 5 ) ,PCR发现 4 78bp的阳性条带。结论 :金葡菌变异为L型后SEB产生量不变 ,其基因也未丢失。

PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因

目的:金黄色葡萄球菌B型肠毒素是污染食品引起食物中毒的主要原因之一,针对进出口食品卫生监测的需要,研究一种简便、快速、准确的实验方法。方法:利用聚合酶链反应技术(PCR)采用特异的模板探针引物进行杂交,最后通过电泳技术与阳性对照进行比对,来判断阴阳性结果。结果:本方法检出率高,每克样品中有有4个金黄色葡萄球菌即可检出, 24h即可报告结果。结论:PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因快速、准确,检测周期短,既可提高检出率,又可节省检测时间。

利用表面等离子体谐振技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素B

本文研究了利用自行研制开发的表面等离子体谐振 (SPR - 2 0 0 0 )生化分析仪检测金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)与其羊单克隆抗体IgG的免疫吸附反应 ,并研究了用SPR技术检测生物大分子相互识别反应相关的一些问题。为了消除溶液间本体折射率差异的影响 ,我们采用牛血清白蛋白 (BSA)本体折射率补偿法 ,使通入流动系统的不同溶液获得基本一样的本体折射率 ,获得了很好的效果。在此基础上 ,SPR - 2 0 0 0生化分析仪初步实验已经能检测到的SEB最低浓度是 1μg/ml,相当于 3 5× 10 -8M。进一步的实验仍在进行中。

金黄色葡萄球菌肠毒素B在变态反应性疾病发病机制中的作用

变态反应性疾病的发病率逐年上升,Ⅰ型超敏反应是其主要的发病机制。近年来研究发现,金黄色葡萄球菌肠毒素B不但可以作为变应原诱导变态反应性疾病的发生,而且还可以作为超抗原影响免疫调节细胞和促炎细胞活性,在变态反应性疾病中发挥极其重要的作用。本文对金黄色葡萄球菌肠毒素B在变应性鼻炎、哮喘及特应性皮炎几种常见变态反应性疾病发生、发展中的作用机制作一综述。

金黄色葡萄球菌肠毒素B对小鼠淋巴细胞产生肿瘤坏死因子-α的影响

目的 观察金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对淋巴细胞产生肿瘤坏死因子 (TNF)-α的影响。方法 密度梯度离心法获得鼠脾淋巴细胞 ,不同时间和浓度的SEB处理 ,流式细胞仪检测产生TNF -α的淋巴细胞阳性率。结果 TNF -α的产生在 5d和 10 0ng·ml-1时达到高峰。结论 SEB能有效刺激淋巴细胞产生TNF -α。