谷氨酸对人交感神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系超极化激活的阳离子通道的影响

目的观察谷氨酸(Glu)对交感神经细胞超极化激活的阳离子通道(Ih通道)活动的影响。方法采用人交感神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系作为交感神经细胞模型,用全细胞电压箝方式记录Ih通道电流。结果 SH-SY5Y细胞存在Ih通道电流;Glu(1mmol/L)可抑制SH-SY5Y细胞Ih电流的K+电流成分,但增强Ih电流的Ca2+电流和Na+电流成分,综合效应是使Ih电流增大。结论 Glu可增大SH-SY5Y细胞的Ih电流。这一效应提示,Glu可能通过诱发交感神经元去极化并促进其传出冲动增加。

Mink相关肽1对超极化激活的环核苷酸门控的阳离子通道4电生理特性的调节

目的:评价Mink相关肽1(KCNE2或MiRP1)对异源转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上的超极化激活的环核苷酸门控的阳离子通道(HCN)4电生理特性的影响。方法:将成功转染HCN4的CHO细胞(n=12)及共转染HCN4+KCNE2的CHO细胞(n=13),即将KCNE2质粒脱氧核糖核酸(DNA)单独转染或和HCN4质粒DNA共转染CHO-K1细胞,用标准微电极全细胞膜片钳记录细胞膜上的HCN4电流。结果:KCNE2对HCN4电流大小的影响:无论是在单独转染HCN4,还是HCN4和KCNE2共转染的CHO细胞中,均能检测到电流的表达。HCN4和KCNE2共转染的细胞中所检测到的电流密度,显著大于单独的HCN4转染细胞中的电流密度,差异有统计学意义(P<0.01)。KCNE2对HCN4激活动力学的影响:KCNE2和HCN4共转染后,其代表通道激活动力学的指标:激活时间常数(Tau)较单独转染HCN4时明显减小,差异有统计学意义(P<0.05)。KCNE2对HCN4激活的电压依赖性的影响:从稳态激活曲线中发现,无论是通道激活50时的脉冲电压(V1/2)还是倾斜因子(S),在HCN4与HCN4+KCNE2两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:KCNE2对HCN4通道有明显的调控作用。

超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道1在杏仁核快速电点燃癫痫大鼠神经元中表达下调

为研究杏仁核快速电点燃癫痫中超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道1(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN1)表达变化,成年Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为假手术组(S)、癫痫模型2h组(EP-2 h)、癫痫模型14d组(EP-14 d)和癫痫模型35 d组(EP-35 d);采用快速电点燃刺激杏仁核方法建立癫痫大鼠模型,观察各组大鼠行为学的变化,研究了海马神经元中HCN1的免疫荧光及3,3-二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)免疫组化表达情况。结果表明:与S组比较,HCN1的免疫荧光显示EP各组海马部位HCN1阳性表达细胞数均减少,且EP-14 d及EP-35 d组减少最明显(P <0. 05); DAB免疫组化显示EP各组HCN1阳性表达均低于S组,且EP-14 d及EP-35 d组降低最明显(P <0. 05)。可见在杏仁核快速电点燃癫痫大鼠模型中,HCN1下调可能参与癫痫的发生和发展。

超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道在心血管系统中作用的研究进展

超极化激活的环核苷酸门控阳离子(HCN)通道为超极化激活的阳离子通道,受电压和环核苷酸双重调节。近期科学家利用低温电磁仪探索了HCN通道的某些特殊结构,为研究相关的离子通道特性提供了理论依据。HCN通道及其亚型在心脏中的分布具有一定的种属特异性,病理状态下各亚型的异常分布常常引起各类心律失常,另外HCN基因突变亦参与病态窦房结的形成。诱导多能干细胞作为一种新兴的具有潜在发展前景的干细胞,将为研究HCN基因突变及其参与心脏离子通道病变的病理生理和分子学变化提供良好的模型,且有利于针对HCN通道的特异性药物和生物起搏器的研发。

窦房结细胞起搏与超极化激活的环核苷酸门控通道关系的研究进展

窦房结是正常心脏活动的起搏点,窦房结细胞的自律性决定心率的快慢,而窦房结细胞4期自动除极是其产生自律性的基础,该过程是通过窦房结细胞膜上多种离子流的共同作用而实现的,其中超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道(HCN)及其产生的电流(If电流)在窦房结细胞起搏电活动中具有重要作用。本文探讨窦房结细胞起搏与超极化激活的环核苷酸门控通道的关系,为临床治疗病态窦房结综合征等缓慢性心律失常提供新的方向。

重组慢病毒介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4基因转染BMSCs的实验研究

目的探讨重组慢病毒（1entivirus，LVs）介导超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道4（hyperpo。larization．activatedcyclicnucleotide．gatedcationchannel4，HCN4）基因转染大鼠BMSCs构建生物起搏细胞的可行性。方法选取3～5周龄SD大鼠，采用改良全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs。以LVs作为转染载体，增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）为标记，构建LVs．HCN4．EGFP病毒液。取第3代BMSCs分别转染LVs—HCN4．EGFP病毒液（实验组）和LVs．EGFP空白病毒液（对照组），荧光显微镜观察转染24、48、72h后两组绿色荧光表达情况，72h时Westernblot检测HCN4蛋白表达；电生理检测实验组转染72h后BMSCs的起搏电流。结果实验组BMSCs形态正常、生长良好；48h后荧光显微镜下可见散在的绿色荧光，转染效率约10％；72h荧光表达稍增多，转染效率为20％～25％。对照组未见绿色荧光表达。Westernblot检测示转染72h后，实验组可见与HCN4蛋白相对分子质量相同的条带表达，而对照组仅有微弱表达；实验组蛋白条带灰度值为33．75±0．41，显著高于对照组的23．39±0．33（t=17．524，P=-0．013）。实验组转染后的BMSCs检测到起搏电流，并能被CsCl完全阻断，符合起搏电流特点。结论重组LVs介导HCN4基因成功转染大鼠BMSCs，并检测到HCN4蛋白表达及起搏电流。

超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道与物质成瘾

物质成瘾是严重危害人类健康的重要因素之一,目前临床上仍然缺乏有效的治疗药物。研究物质成瘾的机制,寻找新的治疗靶点,研发有效的治疗药物是急需解决的重要课题。超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated cation channels,HCN)参与了许多大脑高级活动,与多种脑疾病的发生发展密切相关,其中HCN通道在物质成瘾中的作用及机制研究正逐步得到重视。近年来,关于物质成瘾的研究证实:在多种精神活性物质成瘾的情况下,多个脑区的HCN通道功能或表达出现异常,但至今尚未能全面了解其机制以及这种变化导致的行为学后果。因此,本文综述HCN通道在成瘾性精神活性物质(如阿片类、可卡因类、大麻类、苯丙胺类、酒精和烟草)成瘾中的神经生物学机制,以期为物质成瘾的机制研究和治疗提供新思路。

mHCN4基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞重建起搏离子流通道

目的观察超极化激活的环核苷酸门控通道亚型4(mHCN4)外源基因对小鼠骨髓间充质干细胞(mMSCs)的转染及其功能表达。方法2个月大昆明小鼠拉颈处死,无菌条件下分离股、胫骨,收集骨髓细胞种植于塑料培养瓶,24h后更换培养液,保留贴壁细胞,待细胞达90%融合时胰酶消化传代培养。收集第3代贴壁细胞,用免疫磁珠法分选CD11b-细胞继续扩增培养。以pUC18、pcDNA3-mHCN4、pIRES2-EGFP、pMSCV-puro等质粒载体为架构,用不同酶类将目的片段连接构建pMSCV-mHCN4-EGFP及pMSCV-EGFP逆转录病毒载体。载体转染PT67包装细胞,收集逆转录病毒上清转染第3代扩增的mMSCs细胞,观察mMSCs的转染效果及阳性转染细胞的mHCN4通道动力学特性。结果mMSCs的转染效率约10%～20%。mHCN4基因转染组可记录到明显的时间依赖性的超极化激活内向电流(If),If的半数最大激活电压为-99.0±5.8mV,在-140mV电压时的激活时间常数为451±61ms。该电流对CsCl高度敏感;对照组细胞在超激化状态下无明显的电流出现。结论mHCN4外源基因可在mMSCs中成功表达起搏离子流通道,基因修饰后的mMSCs有可能成为一种有效的生物起搏种子细胞。

电针心经与肺经对急性心肌缺血模型大鼠心肌组织超极化激活的环核苷酸门控通道2表达的影响

目的:通过比较电针心经和肺经腧穴对急性心肌缺血(AMI)大鼠心肌组织超极化激活的环核苷酸门控通道2(HCN 2)mRNA和蛋白表达的影响,探讨电针经穴效应及后效应的相对特异性。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、电针手少阴心经神门组(简称神门组)、电针手太阴肺经太渊组(简称太渊组),每组12只。采用冠状动脉前降支结扎法复制AMI模型。两电针组分别电针"神门""太渊"穴,刺激15min,1次/d,共治疗7d。于末次电针治疗后即刻和次日相同时间各取材6只大鼠,分别称为神门8d组、神门9d组、太渊8d组和太渊9d组。采用实时荧光定量PCR法检测心肌组织HCN 2mRNA表达水平,Western blot法检测HCN 2蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组HCN 2mRNA和蛋白表达水平均显著减少(P<0.01);与模型组比较,神门组及太渊组HCN 2mRNA和蛋白表达量均显著增多(P<0.01);与神门8d组比较,神门9d组的HCN 2mRNA和蛋白表达量均显著增多(P<0.01),但太渊8d组的HCN 2mRNA和蛋白表达量均减少(P<0.01);与神门9d组比较,太渊9d组的HCN 2mRNA和蛋白表达量均显著减少(P<0.01);与太渊8d组比较,太渊9d组HCN 2蛋白表达显著增加(P<0.01)。结论:电针心经和肺经均可以促进AMI模型大鼠心肌组织HCN 2mRNA和蛋白的表达,且具有一定的持续性后效应,电针心经在调整心肌组织HCN 2表达中具有相对特异性。

人HCN2基因编码的心脏起搏通道的电生理

目的将人超极化激活的阳离子通道基因2(human hyperpolarization-activated cation channel2,hHCN2)表达于HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点。方法利用全细胞膜片钳技术,记录转染了hHCN2的HEK293细胞上的超极化激活的阳离子流(If)。结果转染hHCN2的HEK293细胞上表达If样内向电流,在超极化时激活,随刺激电压的延长而增大,半数最大激活电压为(-109.1±0.7)mV,曲线斜率为(-12.7±0.7)mV。刺激电压变负时,激活变快。-100mV和-160mV时,激活时间常数分别为(2.5±1.1)s和(217±29)ms。此电流是细胞外钾离子浓度依赖性的,对钠离子和钾离子的相对通透性为0.67。2mmol/L的Cs+可明显抑制此电流。结论目的基因hHCN2在HEK293细胞上成功表达,表达的蛋白能形成有功能的通道,产生If样电流。

参松养心胶囊对hHCN4起搏电流通道的影响

目的观察通络药物参松养心胶囊提取干粉溶液对人超极化激活的阳离子通道(hHCN4)的影响。方法用细胞外液将参松养心胶囊干粉稀释到0.5%浓度,瞬时转染人类超极化激活的阳离子通道(If)基因hHCN4cDNA到HEK293细胞,利用全细胞膜片钳技术,记录转染了hHCN4的HEK293细胞上的超极化激活的阳离子流。结果If峰值电流密度受到抑制(61.97±16.44vs41.65±13.32,P<0.05);但此抑制可逆(53.83±14.26);药物不改变通道激活动力学参数。结论参松养心胶囊提取干粉溶液可逆性抑制hHCN4起搏电流。

瞬时受体电位M4通道与心血管疾病的研究进展

瞬时受体电位M4(TRPM4)通道是Ca激活的单价选择性阳离子通道,在心血管病理生理学中也起着关键作用。TRPM4在心血管系统分布广泛,现有研究表明该通道与心脏结构及动作电位存在相关性。文章重点综述了现有研究中TRPM4通道生理调控机制以及该通道与心血管疾病关系的研究进展,以期有益于该通道在此方面的后续研究。

含时滞和I_(h)流的神经元的同步放电行为

本文研究了时滞和超极化激活的阳离子流I_(h)对抑制耦合的水蛭神经元的同步放电行为的调控.通过数值仿真揭示了时滞、耦合强度和I_(h)流都能诱发丰富的同步转迁行为,如从同步的周期-6簇放电到同步的周期-1簇放电.借助ISI分岔和快慢变量分离方法获得了I_(h)流诱导同步转迁行为的动力学原因.研究结果表明,时滞和I_(h)流都是影响水蛭神经元同步行为的重要因素.

HCN2阳离子通道:缓解疼痛的新靶点

疼痛长期困扰人类健康,其发病机制纷繁复杂,究竟谁在其中扮演了重要的作用是目前亟待解决的重大问题。随着对疼痛研究的不断深入,超极化激活的环核苷酸门控通道逐渐引起广泛关注。在炎性痛和神经病理性痛过程中,它都扮演了至关重要的作用,其数目改变和开放频率增加都参与介导了疼痛部位的异常放电,成为诱发疼痛的开关。在给与阻断剂或敲除通道2亚型后,能明显缓解炎性痛和神经病理性痛的不良反应,成为可以缓解疼痛发生的新靶点。超极化激活的环核苷酸门控通道在机体分布广泛,参与多种重要生理功能的调节,但目前还没有针对该门控通道某种亚型的特异性阻断剂。在今后,也许超极化激活的环核苷酸门控通道会成为临床治疗疼痛的新靶点,该通道的特异性药物也将为广大患者带来新的福音。

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为具有起搏功能的心肌细胞

目的寻求体外诱导骨髓间充质干细胞分化为具有起搏功能的心肌细胞的方法和途径。方法分离大鼠骨髓间充质干细胞,在体外分别用5-氮胞苷(5AZA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)+内皮细胞生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、干细胞因子(SCF)和窦房结心肌细胞(SAN CMs)裂解液进行诱导。观察细胞形态,用免疫组化和流式细胞技术测定心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43以及超极化激活的核酸环化酶门控的离子通道(HCN)2/4的表达,并测定细胞起搏电流If。结果上述方法均能在体外将干细胞诱导为表达心肌细胞特异性蛋白的心肌样细胞,并且均有HCN2表达。5-AZA、bFGF+EGF和SAN CMs组表达HCN2比例较高(22.9%、22.3%和11%),且均能测到起搏电流(If)的存在。结论窦房结裂解液是体外诱导骨髓间质干细胞分化为具有起搏功能的心肌细胞的理想方法,HCN是很有前景的分选具有起搏功能的心肌细胞的标志蛋白。

右美托咪定对神经病理性疼痛的作用及其机制

目的观察右美托咪定对坐骨神经结扎所致神经病理性疼痛的镇痛作用,从离子通道角度探讨其机制。方法 SD大鼠随机分为3组:CCI组、CCI+Dex组及Sham组,每组9只。CCI组和CCI+Dex组通过结扎坐骨神经建立神经病理性疼痛模型,Sham组只暴露坐骨神经不结扎。术后7天,CCI+Dex组腹腔注射右美托咪定40μg/kg,CCI组腹腔注射等量生理盐水,1次/天,连续3天。大鼠术前、CCI术后7天及注药后3天采用Von Frey纤维测定机械性缩足阈值(PWMT),热辐射法测定缩足潜伏期(TWL)。麻醉后处死大鼠,采用酶解法分离大鼠的腰段背根神经节(DRG)细胞,另将HCN1与HCN2质粒转染至HEK293细胞,全细胞膜片钳记录HEK293细胞及大鼠DRG神经元的HCN电流。结果 CCI术后7天,CCI组及CCI+Dex组大鼠PWMT、TWL较术前降低(P<0.05),而Sham组大鼠的PWMT、TWL与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药3天后,CCI+Dex组PWMT、TWL较给药前增加(P<0.05);而CCI组给药前后PWMT和TWL无明显变化。与Sham组比较,CCI组与CCI+Dex组DRG神经元Ih幅度均增加,V1/2值降低(P<0.05);与CCI组比较,右美托咪定治疗后的大鼠DRG神经元Ih幅度降低,V1/2值增加(P<0.05)。另外右美托咪定(0.1~10μmol/L)抑制HEK 293细胞中的HCN1和HCN2电流,导致最大电流降低,Ih抑制率增加,V1/2向超极化方向改变(P<0.05)。结论右美托咪定可缓解神经病理性疼痛,这可能与其抑制DRG神经元Ih有关。

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心脏起搏样细胞的研究

目的探讨超极化激活的环核苷酸门控通道亚型4(mHCN4)基因修饰对大鼠骨髓间充质干细胞(rM-SCs)体外定向分化为心脏起搏样细胞的影响。方法以构建的mHCN4逆转录病毒载体转染第三代rMSCs,获取稳定高效表达mHCN4基因的细胞,观察细胞形态学改变,并进行α-actin、TroponinT、HCN4、Connexin43等基因表达检测。结果rMSCs转染mHCN4基因后,可获得高效稳定表达mHCN4的细胞,经连续不传代培养后出现大量的肌管样分化,并出现自主搏动的细胞,α-actin、TroponinT、HCN4表达检测均为阳性;而只转染绿荧光蛋白(GFP)的rMSCs仅出现少量的肌管样分化,并未观察到细胞的自主搏动;未转染组MSCs则未观察到肌管样分化。结论mHCN4基因修饰的rMSCs可在体外定向分化为具有自律性的心脏起搏样细胞,而mHCN4基因活化可能是促进rMSCs向心脏起搏样细胞分化的关键因素。

异丙酚对离体大鼠下丘脑视上核神经元的抑制作用

为了观察新型静脉全麻药异丙酚对下丘脑视上核(supraoptic nucleus,SON)神经元的作用,并分析其可能的离子机制,本研究应用细胞内记录技术,观察异丙酚灌流对成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠下丘脑冠状切片SON神经元膜电学性质和动作电位的影响。结果显示,0.1mmol/L异丙酚使SON神经元静息电位显著降低(P<0.01),而0.3和1.0mmol/L异丙酚显著缩短膜时间常数、减小斜率电阻(P<0.01)。在超极化电流脉冲幅值大于0.5nA时,部分(11/18)SON神经元可表现出超极化激活的阳离子通道(hyperpolarization-activated cation channel,Ih通道)所致的异常整流现象,而异丙酚能可逆地取消该异常整流现象。0.1mmol/L异丙酚可显著提高SON神经元阈电位水平(P<0.01),显著降低最大上升斜率(Max L.slope)(P<0.05),而0.3和1.0mmol/L异丙酚可完全取消部分(分别为1/18和12/17)SON神经元的动作电位。对于未被异丙酚完全取消动作电位的SON神经元,0.3mmol/L异丙酚可显著降低锋电位的幅度(P<0.05)。0.3～1.0mmol/L异丙酚可显著抑制0.1～0.7nA去极化电流时的神经元放电频率,使电流刺激强度-放电频率曲线右移和压低。以上结果提示,异丙酚可降低下丘脑SON神经元的兴奋性,其机制可能涉及对Ih通道和Na+通道的抑制。