超极化激活的环核苷酸门控通道1参与七氟烷诱导的顺行性遗忘作用的机制研究

目的旨在探讨超极化激活的环核苷酸门控通道1(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 1,HCN1)在七氟烷诱导的顺行性遗忘中的作用机制。方法采用雄性SPF级C57BL/6J野生型小鼠(WT组,n=60)和HCN1基因全身敲除(HCN1-/-)小鼠(HCN1-/-组,n=60)。将两组小鼠分别暴露于不同浓度的七氟烷(0%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%)下,每个浓度10只小鼠。随后进行条件性恐惧实验,计算两组小鼠七氟烷抑制条件性恐惧记忆的半数效应浓度(median effective concentration,用EC50表示)。采用全细胞膜片钳技术记录0.125mmol/L七氟烷浓度灌流液对转染HCN1的人胚肾293细胞(HEK293-HCN1)上HCN1电流的影响,比较七氟烷处理前(Control组)和处理后(Sevoflurane组)HCN1电流的变化。结果与-/-WT组小鼠相比,HCN1组小鼠在七氟烷抑制场景恐惧记忆和声音恐惧记忆中的EC50值升高,差异有统计学意义(场景恐惧记忆:0.18%比0.26%,P<0.001;声音恐惧记忆:0.47%比0.49%,P<0.001)。全细胞电生理记录显示,与基础值相比,0.125mmol/L七氟烷抑制HEK293-HCN1细胞在﹣90~﹣140mV范围内的电流幅度(P值均<0.05),并增加了半最大激活电压(V1/2a)值[(﹣108±2.9)mV比(﹣100.1±3.0)mV,(P<0.001)]。结论HCN1电流的抑制可能参与了七氟烷诱导的顺行性遗忘作用。

超极化激活环核苷酸门控通道4和钙依赖性蛋白激酶Ⅱ在心源性猝死患者窦房结中的表达情况及其法医学意义

目的探讨心源性猝死(SCD)患者窦房结组织超极化激活环核苷酸门控通道4(HCN4)和钙依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)蛋白表达情况及其法医学意义。方法收集2018年1月至2022年12月川北医学院司法鉴定中心尸检心脏标本200份,其中SCD100份(SCD组),非SCD100份(非SCD组)。两组均进行常规苏木精-伊红(HE)染色,采用免疫组织化学方法检测两组标本窦房结组织中HCN4和CAMKⅡ蛋白表达,图像处理软件计算目的蛋白的AOD值。结果SCD以成年男性为主且在死因中以冠心病占比最多。SCD组中HCN4的AOD值低于非SCD组,CAMKⅡ的AOD值高于非SCD组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论窦房结中HCN4、CaMKⅡ异常表达可能是心源性猝死的机制,HCN4、CaMKⅡ有望成为心源性猝死的分子标记。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4在大鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞中的表达

目的:探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)在大鼠体内和体外心肌成纤维细胞、心肌细胞中的表达分布及其增龄变化。方法:SD大鼠分为新生组(1~3 d),成年组(17个月)和老年组(22个月),每组8只,其中4只用于冰冻切片,另4只用于PCR;取新生SD大鼠心,酶消化法分离培养原代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞。用免疫荧光、免疫组织化学检测原代心肌成纤维细胞和原代心肌细胞HCN4的表达;免疫印迹、实时荧光定量PCR检测原代心肌成纤维细胞HCN4的表达,用实时荧光定量PCR检测不同月龄大鼠心肌组织HCN4的表达。结果:体外细胞培养显示,成纤维细胞和原代心肌细胞中均表达HCN4。组织切片显示,新生、成年和老年大鼠心肌成纤维细胞和部分心肌细胞表达HCN4。P1~P4代成纤维细胞的免疫印迹和实时荧光定量PCR结果显示HCN4随着成纤维细胞代次增加,表达量逐渐降低;不同月龄大鼠左心室的实时荧光定量PCR结果显示随着大鼠月龄增加,HCN4的表达量逐渐降低,其结果与培养的细胞表达一致。结论:HCN4在心肌成纤维细胞和部分心肌细胞中表达。随增龄变化,心肌细胞和成纤维细胞HCN4的表达量逐渐下降。

Mink相关肽1对超极化激活的环核苷酸门控的阳离子通道4电生理特性的调节

目的:评价Mink相关肽1(KCNE2或MiRP1)对异源转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上的超极化激活的环核苷酸门控的阳离子通道(HCN)4电生理特性的影响。方法:将成功转染HCN4的CHO细胞(n=12)及共转染HCN4+KCNE2的CHO细胞(n=13),即将KCNE2质粒脱氧核糖核酸(DNA)单独转染或和HCN4质粒DNA共转染CHO-K1细胞,用标准微电极全细胞膜片钳记录细胞膜上的HCN4电流。结果:KCNE2对HCN4电流大小的影响:无论是在单独转染HCN4,还是HCN4和KCNE2共转染的CHO细胞中,均能检测到电流的表达。HCN4和KCNE2共转染的细胞中所检测到的电流密度,显著大于单独的HCN4转染细胞中的电流密度,差异有统计学意义(P<0.01)。KCNE2对HCN4激活动力学的影响:KCNE2和HCN4共转染后,其代表通道激活动力学的指标:激活时间常数(Tau)较单独转染HCN4时明显减小,差异有统计学意义(P<0.05)。KCNE2对HCN4激活的电压依赖性的影响:从稳态激活曲线中发现,无论是通道激活50时的脉冲电压(V1/2)还是倾斜因子(S),在HCN4与HCN4+KCNE2两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:KCNE2对HCN4通道有明显的调控作用。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道研究进展

离子通道是镶嵌在细胞膜脂质双层中的跨膜蛋白,其基本功能是产生生物电,并通过完成对某些离子的转运维持细胞内环境稳定。近十年研究表明超极化激活的阳离子通道对动物的生理过程产生非常重要的作用,其分子机制与作用于中枢神经系统调节突触的整合、突触的传递、抑制海马的长时程增强等有关,临床研究显示脑的自发放电、心脏的起搏电流、病理性疼痛的产生等与此有关。

超极化激活的环核苷酸门控的阳离子通道与神经疾病关系的研究进展

二十世纪70年代末和80年代初,人们在心脏窦房结细胞和神经元发现了一类称为超极化激活的环核苷酸门控的阳离子通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gatedcation channel,HCN）,该通道是一类有孔阳离子通道,激活可产生Ih电流（hyperpolarization-activated current）,所以本质上HCN也代表着Ih电流。HCN通道的激活依赖于膜的超级化,对Na＋、K＋具有通透性,

肥厚型心肌病患者超极化激活环核苷酸门控阳离子通道mRNA的表达

目的探讨肥厚型心肌病患者超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)的表达。方法构建重组质粒,用梯度稀释的质粒模板建立SYBRGreen荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测HCN4的标准曲线,利用建立的RT-PCR体系对肥厚型心肌病和正常心肌组织标本的左室HCN4mRNA进行检测。结果成功构建了质粒重组子,并建立用SYBRGreen荧光染料在RNA水平检测HCN4通道的标准曲线。HCN4通道在肥厚型心肌病中的表达水平高于正常心肌。结论肥厚型心肌病患者HCN4mRNA的表达较正常人增高。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4基因与心脏节律发生、发展及预后的关系

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4基因在心脏节律的发生、发展及预后中有着重要的作用。研究表明,HCN4基因为窦房结起搏细胞产生自动节律的基础,也可影响心脏传导系统功能发育,其突变与病窦综合征有着密切的关系。通过HCN4起搏通道基因的转染技术构建生物心脏起搏器具有重要的生理意义。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)与心脏生物起搏的研究进展

心脏兴奋刺激来源于窦房结（sinoatrial node，SAN），并经结间束传导至房室结（atrioventrieular node，AVN），通过房室结纤维传导至心室浦氏纤维。心脏兴奋起源、传导等障碍是形成心律失常的基础。研究发现在心脏起搏中，有一种在超极化时激活，受环核苷酸调控的离子通道，一般称作超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（hyperpolarization—activated and cyclic nucleotide—gate cation channel，HCN）。超极化激活的阳离子电流命名为If（funny current）或Ih（hyperpolarization current）。If的最重要作用在于使心脏起搏细胞产生自动节律，保证心脏的节律性和规则性跳动，是保证心脏正常的生理功能的前提。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN）对大鼠海马突触传递功能的调控作用研究

二十世纪80年代初Di Franeesco和Irisawa等学者在研究窦房结起搏活动时发现一种离子流（funny current，If，或queer current，Iq），即超极化激活-环核苷酸门控的阳离子通道（hyperpolarization—activated cyclic nucleotide—gated cation channel，HCN），HCN通道为一多基因家族，至少含有HCNl-4四个成员，最近HCN家族亚单位已被克隆，每一亚单位形成的离子通道均具有内在If电流的主要特征。编码If通道的几种cDNA均已被克隆。在脊椎动物如大鼠、小鼠、兔和人的中枢以及外周组织，HCNl-4皆有高度表达。HCN1，HCN2，HCN4在心脏表达丰富。HCN1在大鼠，小鼠的新皮层、海马、丘脑、小脑等表达丰富；HCN2在嗅球、皮层、海马、丘脑、脑干和小脑亦表达丰富；HCN3在中枢表达水平相对较低；HCN4在嗅球、丘脑及松果体有较高的表达。HCN通道由4个亚单位组成，每个亚单位含有6个跨膜螺旋片断（S1-6），起电压传感器作用的S4片断和介于S5与S6之间的离子孔道即P区，HCN通道C端含有环核苷酸结合区（cyclic nucleotide-binding domain，CNBD）该区与其他几种环核苷酸结合包括cAMP和cGMP激活的蛋白激酶。HCN家族成员之间跨越S1片断到C末端CNBD区氧基酸序列高度保守．N末端与C末端则相反．在长度上变异较大只具有较低的同源性。

超极化激活环核苷酸门控的超极化阳离子通道在神经系统中的分布与功能

对超极化激活环核苷酸门控的超极化阳离子通道（hyperpolarization—activated cyclic nucleotide—gated cation channel，HCN）的研究起源于Ih的发现，1976年Noma首次报道在家兔心脏窦房结组织记录到一种超极化激活的内向电流，称为。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道在脑缺血及其认知功能障碍中的作用

超极化激活环核苷酸门控阳离子（hyperpola rization activated cyclic nucleotide gated cation,HCN）通道属于一种特殊的电压门控离子通道。目前研究结果显示,HCN通道各亚型在基因和蛋白表达层面的变化对疾病的发生、发展及预后可产生极大影响,如参与神经系统的颞叶癫痫、神经病理性疼痛、脑缺血等疾病。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道功能抑制剂ZD7288通过凋亡途径对大鼠脑缺血再灌注损伤发挥神经保护作用

目的运用大脑中动脉线栓(MCAO)法建立大鼠缺血2 h/再灌注22 h的脑缺血再灌注损伤模型,从凋亡途径探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子(HCN)通道功能抑制剂ZD7288对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。方法 (1)健康成年SD雄性大鼠,随机分为4组:假手术组、模型组、ZD7288组和MK-801组,通过MCAO法制备右侧大脑中动脉缺血2 h/再灌注22 h脑缺血模型。于缺血前2 h经侧脑室给予药物,假手术组及模型组给予生理盐水5μL,ZD7288组给予ZD7288 5μL(5 g·L^(-1)),MK-801组给予MK-801 5μL(330 g·L^(-1)),再灌注22 h后处死大鼠。(2)通过神经行为学评分及TTC染色测量脑梗死体积评价脑缺血后脑损伤。(3)运用HE染色法观察脑缺血再灌注后各组皮质及海马神经元细胞结构改变。(4)TUNEL染色法评估脑缺血再灌注后各组皮质及海马神经元凋亡。(5)运用免疫组化方法检测脑缺血再灌注后各组HCN1和HCN2蛋白及凋亡相关蛋白AIF,P53及胱天蛋白酶3的表达。(6)运用Western蛋白质印迹法检测脑缺血再灌注后各组HCN1和HCN2蛋白及凋亡相关蛋白胱天蛋白酶3,AIF,Bax,Bcl-2和P53的表达。结果 (1)TTC染色后计算各组大鼠脑缺血2 h/再灌注22 h后脑梗死体积。与假手术组相比,模型组梗死体积明显增加(P<0.01),ZD7288组脑梗死体积较模型组相比显著下降(P<0.05)。(2)神经行为学评分结果显示,与假手术组相比,模型组神经行为学评分明显上升(P<0.01),ZD7288组与模型组相比显著下降(P<0.01)。(3)HE染色观察各组大鼠皮质和海马CA1,CA3及DG区神经元的病理变化。假手术组大鼠皮质和海马CA1,CA3及DG区神经细胞排列整齐紧密,胞核清晰,细胞核大而圆,可见小胶质细胞和星型胶质细胞。与假手术组相比,模型组神经元细胞排列散乱,核固缩深染,呈三角形或不规则形状,出现较多月牙形病理改变细胞。给予ZD7288后,大鼠皮质和海马CA1及海马DG区神经细胞病理变化较模型组相比均有所改善,海马CA3区变化不明显。(4)TUNEL结果显示,与假手术组相比,模型组凋亡细胞明显增多(P<0.01)。给予ZD7288后,凋亡细胞数较模型组相比明显减少(P<0.01)。各区凋亡率统计分析可知,模型组皮质和海马CA1,CA3及DG区细胞凋亡数与假手术组相比明显增加(P<0.01)。给予ZD7288后,与模型组相比,皮质及海马DG区细胞凋亡数明显减少(P<0.01),海马CA1区细胞凋亡数减少(P<0.05),而海马CA3区变化不明显。(5)免疫组化结果显示,HCN1和HCN2主要在胞膜中表达,与假手术组相比,模型组皮质HCN1表达增强(P<0.05),海马CA1,CA3及DG区表达明显增强(P<0.01)。给予ZD7288后,与模型组相比,皮质HCN1表达下降(P<0.05),海马CA1及DG区HCN1表达明显下降(P<0.01),CA3区无明显变化。HCN2表达与HCN1表达趋势一致。AIF,Bax,P53和胱天蛋白酶3在胞膜和胞核中均有表达。与假手术组相比,模型组皮质和海马CA1及DG区AIF,P53,Bax及胱天蛋白酶3表达明显增强(P<0.01),而Bcl-2表达明显减少(P<0.01)。与假手术组相比,模型组海马CA3区胱天蛋白酶3表达明显增强(P<0.01),AIF和P53表达增强(P<0.05),而Bcl-2表达明显减少(P<0.01)。给予ZD7288后,皮质和海马CA1及DG区AIF,P53,Bax及胱天蛋白酶3的表达较模型组相比明显下降(P<0.01),海马CA3区AIF和P53表达下降(P<0.05),海马CA3区胱天蛋白酶3的表达无明显变化。与模型组相比,ZD7288组皮质、海马CA1和CA3及DG区Bcl-2的表达明显增强(P<0.01)。(6)Western蛋白质印迹结果显示,与假手术组相比,模型组HCN1,HCN2,AIF,P53,Bax及胱天蛋白酶3表达水平上调(P<0.05),Bcl-2表达水平下调(P<0.05);给予ZD7288后,HCN1,HCN2,AIF,P53,Bax及胱天蛋白酶3表达水平较模型组相比下调(P<0.05),而Bcl-2表达水平上调(P<0.05)。结论 (1)HCN通道抑制剂ZD7288能减少脑梗死体积,改善神经行为学评分,改善神经元病理变化,改善神经元细胞凋亡情况,对大鼠缺血2 h/再灌注22 h后脑损伤具有神经保护作用。(2)HCN通道特异性抑制剂ZD7288对缺血2 h/再灌注22 h造成的脑损伤的神经保护作用与神经元凋亡存在一定的关系,具体机制与调节AIF,P53,Bax,Bcl-2和胱天蛋白酶3蛋白表达有关,其通过抑制促凋亡蛋白AIF,P53,Bax和胱天蛋白酶3蛋白表达并促进抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达发挥神经保护作用。

不同发育时段大鼠心肌组织中超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4阳性细胞的分布特征

目的探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(HCN4)在不同发育时期大鼠心肌组织中各类细胞的表达规律,为进一步研究HCN4对心肌的作用提供形态学依据。方法出生1 d、1月、3月、6月健康SD大鼠各15只。取新鲜心脏,石蜡切片和冷冻切片,利用免疫组织化学和荧光技术观察不同发育时段大鼠心肌组织HCN4阳性细胞的表达分布情况及形态学特征。利用Western blotting技术观察左右心室HCN4的蛋白含量。结果免疫组织化学和荧光染色结果显示,HCN4阳性细胞在出生后1 d、1月、3月、6月的血管平滑肌细胞,心内膜和血管的内皮细胞,心外膜的间皮细胞、成纤维细胞,大量心房肌细胞和少量心室肌细胞、传导组织细胞均有表达,但不同部位的表达细胞数量不均;Western blotting结果显示,心室HCN4蛋白随着月龄的增加表达逐渐降低。结论 HCN4在大鼠心肌组织中的表达随年龄的增加逐渐下降,但增殖能力较强的细胞持续存在,提示HCN4可能对心肌组织中的多种细胞的生存起调控作用。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道参与中枢神经系统疾病研究进展

超极化激活环核苷酸门控阳离子(HCN)通道能被超极化电压激活,参与神经元节律、突触活动,膜电阻和树突整合等重要生理功能。目前研究表明,HCN通道在多种中枢神经系统疾病中均发挥重要作用,如颞叶癫痫、神经病理性疼痛、学习记忆障碍和药物成瘾等。本文就近几年HCN通道在中枢神经系统疾病发生过程中的研究进展进行综述。

超极化激活环核苷酸门控阳离子通道亚型在大鼠脊髓背角浅层的特异性表达

目的:探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels,HCN通道)4种亚型在大鼠脊髓背角浅层的表达与分布特点。方法:选取3~5周龄SD大鼠,雌雄不拘,制作L4~L5段脊髓横切片,应用免疫组织化学技术及激光共聚焦成像技术,观察HCN通道的4种亚型在脊髓背角浅层神经元、胶质细胞及神经元亚细胞结构中的分布。结果:HCN通道不同亚型在正常SD大鼠脊髓背角中的表达和分布具有特异性:(1)HCN1主要与神经元标志物[神经元核抗原(neuronal nuclei,NeuN)]和星形胶质细胞标志物[胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)]共存,HCN2和HCN3主要与NeuN共定位;(2)HCN2主要与肽能初级传入神经末梢标志物[降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)]共存,HCN4主要与非肽能初级传入神经末梢标志物[异凝集素B4(isolectin B4,IB4)]共存;(3)HCN1和HCN4主要与神经元树突标志物[微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)]共存;(4)HCN4主要与抑制性中间神经元轴突末梢标志物[囊泡γ-氨基丁酸转运体(vesicularγ-aminobutyric acid transporter,VGAT)]共存。结论:HCN1~4主要分布在大鼠脊髓背角浅层,且在神经元、胶质细胞及神经元亚细胞结构中呈特异性分布。

超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道与疾病关系的研究进展

随着对超极化激活电流和超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道研究的不断深入，人们对超极化激活电流特性和超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道的结构特征、调节、分布有了进一步的了解。近年来，发现除心律失常之外，超极化激活电流异常和超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道的机能障碍还与其他多种疾病有关。本文就超极化激活电流特性、超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道的特点及二者功能异常与疼痛等神经系统疾病关系的最新研究进展予以综述。