绿盲蝽超气门蛋白ALUSP的克隆、原核表达及纯化

【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因(ALUSP),获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进行诱导表达,再通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得ALUSP功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量56.63 kD,理论等电点8.42;序列特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征,由A/B域(249 bp)、C域(198 bp)、D域(69 bp)和E域(489 bp)组成,其中C域高度保守,包含2个锌脂结构并含有1个P-盒和1个D-盒,且含有由8个氨基酸构成的核定位信号,D域含有1个识别DNA元件的T-盒,E域含有1个由8个α螺旋和1个β折叠形成袋状结构;氨基酸比对结果表明,ALUSP的氨基酸序列与稻绿蝽USP序列一致性最高(57.82%),与其他昆虫的USP序列一致性较低,如膜翅目的 Melipona scutellaris(46.05%)、Scaptotrigona depilis(45.94%);系统进化树分析结果显示,半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP较为分化,位于不同分支,ALUSP与稻绿蝽USP进化关系最近,可能来源于共同的祖先。EcoR I和Xho I双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pEGX-6P-1载体上,命名为pEGX6P1-ALUSP;经37℃、1.0 mmol·L-1的IPTG诱导的pEGX6P1-ALUSP重组质粒可特异性表达1个约65 kD的蛋白,并且该重组ALUSP蛋白主要以包涵体形式存在;收集含有目的基因的菌株进行GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析,最后进行复性和纯化后在65 kD附近仅出现1条清晰的特异性条带,表明已得到纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP全长,其具有昆虫超气门蛋白的典型特征,并获得了原核表达的重组蛋白。

斜纹夜蛾蜕皮激素受体与超气门蛋白的原核表达及活性检测

双酰基肼类杀虫剂模拟天然蜕皮激素作用影响幼虫蜕皮。昆虫蜕皮激素受体的高度敏感性和专一性要求必须建立新的杀虫活性检测技术,以适应快速准确和大批量筛选的要求。本研究采用RT-PCR技术,获取斜纹夜蛾Spodoptera litura蜕皮激素受体(EcR)与超气门蛋白(USP)功能域目的基因,构建EcR、USP功能区基因原核表达载体(pEHISEGFPTEV-EcRcde和pEHISEGFPTEV-USPcde)。载体经诱导表达和蛋白纯化,获得EcR和USP功能区纯化蛋白。在蛋白浓度l mg/mL,3H-PonA终浓度8 nmol/L的条件下,采用放射性配基受体结合分析测定了4种药剂(虫酰肼、呋喃虫酰肼、抑食肼和灭幼脲)不同浓度下的放射性比活的变化。结果显示:随着药剂浓度的逐渐增大,前3种药剂的放射性比活都有不同程度的降低,其中虫酰肼的放射性比活降低程度最大,其次是呋喃虫酰肼和抑食肼,灭幼脲的放射性比活基本无变化。这些结果表明相同条件下虫酰肼比呋喃虫酰肼和抑食肼有更高的杀虫活力,本研究的方法可对双酰基肼类杀虫剂或者先导化合物进行初步筛选。

蜕皮激素受体和超气门蛋白基因在柞蚕发育过程及激素诱导后的表达模式

昆虫蜕皮激素受体和超气门蛋白形成的异源二聚体介导蜕皮激素信号,起始包括转录因子表达在内的蜕皮级联反应,从而使昆虫进入蜕皮和变态等生命过程。克隆了柞蚕的2个蜕皮激素受体相关基因,命名为Ap EcRB1(Gen Bank登录号:KY411159)和Ap USP1(Gen Bank登录号:KY411160)。2个基因的ORF序列全长分别为1 758 bp、1 401 bp,编码585个、466个氨基酸。半定量RT-PCR检测这2个基因除在柞蚕幼虫血淋巴中不表达之外,在其他组织中均有表达,在丝腺和脂肪体中的表达量较高。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析2个基因在幼虫蜕皮前及化蛹前后呈现大幅度上调表达的规律。注射20-羟基蜕皮甾酮(20E)诱导启动滞育蛹的发育,结果诱导组的滞育蛹经过17 d羽化,比对照组滞育蛹提早羽化。滞育蛹中2个基因的表达量在注射20E后均明显下降,其中Ap EcRB1在蛹发育后期的12 d内一直处于较低水平,但羽化前期其表达量急剧上升,蛹发育16 d(羽化前1 d)达到最高;Ap USP1基因的表达量从注射后8 d开始升高,至16 d时达到最高。以上研究结果丰富了柞蚕变态发育过程中蜕皮激素调控作用的分子信息。

蜕皮激素诱导家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的表达变化

昆虫蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)是一种核内受体,为蜕皮激素的分子靶标。用0.002 g/L蜕皮激素溶液浸泡过的桑叶饲喂家蚕5龄幼虫,采用双跟踪标定定量PCR(dual-spike-in qPCR)方法,检测家蚕蜕皮激素受体基因BmEcR-A、BmEcR-B1和超气门蛋白(ultraspiracle,USP)基因BmUSP在家蚕幼虫马氏管、脂肪体、中肠组织的转录水平变化,分析蚕体组织以及BmEcR和BmUSP基因在蜕皮激素代谢过程中的作用与表达调控特征。结果表明:家蚕EcR的2种同工型基因BmEcR-A和BmEcR-B1的mRNA转录水平均变化显著,在脂肪体中的转录水平最高,其它组织相对较低;BmUSP的mRNA转录水平同样变化显著,且在脂肪体中的转录水平最高,马氏管次之,中肠最低。另检测正常情况下4龄眠期和5龄末期BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP的mRNA转录水平相对于其它发育时期较高,且脂肪体中的转录水平要明显高于其它组织。BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP均在家蚕幼虫脂肪体中高水平表达,表明了脂肪体在蜕皮激素代谢过程中的重要性。

家蚕蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的诱导表达模式及蜕皮激素响应元件核心保守区的识别

核受体基因家族是介导昆虫蜕皮激素(20E)作用的关键信号分子。为了研究家蚕丝腺中核受体异源二聚体编码基因——蜕皮激素受体基因Bm EcR和超气门蛋白基因Bm USP的表达模式,应用实时荧光定量PCR技术检测家蚕5龄幼虫正常状态下和用2×10^(-3)μg/μL蜕皮激素处理后Bm EcR与Bm USP在丝腺组织中的表达变化。结果表明,20E处理后,Bm EcRA、Bm EcR-B1和Bm USP在中、后部丝腺的表达量与对照组相比均有不同程度增加,说明20E能够促进Bm EcR-A、Bm EcR-B1和Bm USP基因的表达;但中部丝腺与后部丝腺Bm EcR-A、Bm EcR-B1和Bm USP基因的表达变化趋势不同。利用等温滴定量热技术(ITC)获得的家蚕蜕皮激素受体结构域蛋白Bm EcR-B1D与蜕皮激素响应元件Bm E75A-EcRE及其缺失突变体相互作用的亲和力常数(K)、反应热(ΔH)和熵(ΔS),显示了Bm EcR-B1D蛋白能够与Bm E75A-EcRE进行结合,并发现Bm E75A-EcRE的核心保守区为编码序列TCTTC,推测该区域有可能是Bm EcR-B1D蛋白结合在Bm E75A-EcRE上的精确位点。

三化螟蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的克隆和序列分析

利用RACE技术,根据已有的三化螟转录组数据,设计特异引物对三化螟的蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)基因进行克隆,获得了三化螟EcR和USP基因的全长序列。EcR基因全长2857bp,氨基酸序列包括545个氨基酸。USP基因全长共2082bp,氨基酸序列包括408个氨基酸。序列比对后发现,三化螟EcR和USP基因的氨基酸序列与已报道的鳞翅目昆虫EcR和USP基因的氨基酸序列具有很高的同源性,其中与二化螟的相似性分别达到94%和97%。序列分析表明,三化螟EcR和USP序列具有昆虫EcR和USP基因的特征结构:DNA结合域和2个锌指结构。

核受体基因SfUSP调控白背飞虱蜕皮发育

【目的】为探究核受体超气门蛋白(ultraspiracle protein, USP)在白背飞虱Sogatella furcifera若虫蜕皮发育过程中的功能及其与几丁质合成和降解之间的调控关系。【方法】基于白背飞虱基因组数据,结合RT-PCR克隆SfUSP全长cDNA序列;利用RT-qPCR测定白背飞虱不同发育阶段(1-5龄若虫、5龄若虫蜕皮前、5龄若虫蜕皮中和雌成虫)、5龄若虫组织(头、体壁、脂肪体、肠道和足)、雌成虫组织(体壁、翅、脂肪体、足和卵巢)以及100 ng/头20E处理后5龄第1天若虫中SfUSP的表达量;通过显微注射dsRNA靶向沉默5龄第1天若虫的SfUSP后,计算若虫存活率,观察若虫致死表型,利用RT-qPCR测定几丁质合成和降解通路关键基因的表达量。【结果】克隆获得了白背飞虱SfUSP(GenBank登录号:ON209396)的全长cDNA序列,其开放阅读框长1 263 bp,编码420个氨基酸,SfUSP蛋白预测分子量为47.27 kD,理论等电点为7.18。序列分析结果表明,SfUSP含有核受体家族所具备的5个保守结构域,并且DNA结合域(DNA-binding domain, DBD)和配体结合域(ligand-binding domain, LBD)高度保守。发育阶段表达谱表明,SfUSP在1龄若虫、5龄若虫蜕皮前以及雌成虫中高表达;组织表达谱显示,SfUSP在5龄若虫头、体壁、脂肪体和肠道中的表达量较高;在雌成虫翅、足和体壁中的表达量较高。显微注射100 ng/头20E后12 h时,5龄若虫中SfUSP的表达量显著高于对照组的。靶向沉默SfUSP表达后,与注射dsGFP的对照组相比,显著降低了白背飞虱的若虫存活率,显微注射dsRNA 6 d时若虫存活率仅为对照组的18.01%,其中不能成功蜕皮个体占51.46%;显著抑制了几丁质合成通路关键基因SfCHS1,SfCHS1a,SfUAP,SfGFAT和几丁质降解通路关键基因SfCht7,SfNAG1,SfNAG2,SfCDA1,SfCDA2和SfCDA4的表达量,但是显著提高了SfG6PI和SfCht10的表达量。【结论】SfUSP是白背飞虱生长发育过程中的关键基因,能够影响几丁质的合成与降解,进而调控白背飞虱的蜕皮发育。

拟黑多刺蚁成虫头部USP基因的定位与定量分析及其与EcR基因相关性

【目的】超气门蛋白(ultraspiracle protein,USP)是蜕皮激素作用靶标的重要组成部分。本研究拟通过分析在拟黑多刺蚁Polyrhachis vicina Roger USP基因PvUSP在不同品级成虫头部mRNA表达的差异,推测PvUSP对其脑神经功能或行为的影响;拟通过饲喂PvUSP dsRNA对拟黑多刺蚁不同品级成虫PvUSP进行RNA干扰(RNAi),推测PvUSP对虫体生理功能的影响及其与蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)基因PvEcR之间功能的相关性。【方法】利用荧光原位杂交及荧光实时定量PCR技术对拟黑多刺蚁不同品级成虫头部PvUSP mRNA组织分布与表达水平进行检测;通过饲喂PvUSP dsRNA对拟黑多刺蚁不同品级成虫PvUSP进行RNAi,采用荧光实时定量PCR检测拟黑多刺蚁PvUSP与PvEcR表达水平的变化。【结果】PvUSP mRNA广泛表达于拟黑多刺蚁不同品级成虫头部(主要分布于蕈形体),不同品级成虫头部PvUSP mRNA的表达量不同,工蚁头部表达量最高,雄蚁头部次之,雌蚁头部的表达量最低;RNAi沉默PvUSP后,与对照组相比,PvUSP mRNA在不同品级拟黑多刺蚁成虫体内表达量均明显降低,并存在显著差异(P<0.01);与对照组相比,PvEcR mRNA在各品级表达量均有增加,工蚁和雄蚁表达量变化不显著(P>0.05),但雌蚁体内PvEcR mRNA表达量显著增加(P<0.05)。【结论】PvUSP基因对拟黑多刺蚁不同品级头部神经系统的构建、功能作用的发挥有关;拟黑多刺蚁PvUSP基因与PvEcR基因可能在异源二聚体形成过程中存在关联性或功能的互补性;PvUSP可能对雌蚁的生殖功能产生重要影响。

沉默蜕皮激素受体对雌性中黑盲蝽生殖力的影响

中黑盲蝽Adelphocoris suturalis是一种重要的农业害虫,主要为害棉花、果树和牧草等作物。昆虫保幼激素(juvenile hormone, JH)与蜕皮激素(molting hormone, 20E)是调控昆虫生殖的主要因素。本研究运用基因克隆、基因沉默(RNAi)、实时荧光定量PCR(qPCR)等技术研究蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)、超气门蛋白(ultraspiracle protein, USP)在中黑盲蝽生殖调控中的作用。结果表明,中黑盲蝽EcR基因的ORF全长1 413 bp,编码470个氨基酸。预测蛋白质分子量为53.65 kD,pI值为7.79。中黑盲蝽USP基因ORF全长1 209 bp,编码402个氨基酸。预测蛋白质分子量为44.99 kD, pI值为7.94。与对照相比,注射dsEcR、dsUSP后6~18 d的中黑盲蝽体内EcR基因、USP基因在转录水平分别被显著抑制;卵巢的挂卵量分别仅有对照组的31.5%、86.6%;单雌产卵量减少36.0%~80.4%,显著低于对照。EcR和USP基因沉默后,产卵前期与对照相比无显著差异;雌成虫寿命比对照组减少2.4~5 d。上述研究表明,沉默蜕皮激素信号通路的2个关键基因EcR和USP对中黑盲蝽的生殖力产生显著的影响,蜕皮激素信号通路可能是中黑盲蝽生殖调控的关键信号通路之一。

家蚕的蜕皮激素受体和超气门蛋白在大肠杆菌中的共表达和纯化

构建蜕皮激素受体(Ecdysteroid receptor,EcR)和超气门蛋白(Ultraspiracle,USP)的表达载体,使两者在大肠杆菌内高效共表达,获得具有活性的目的蛋白,即EcR和USP的复合蛋白(EcR-USP)。将N端带有6×His tag的EcR目的基因片段克隆于p ET21b MDX12(+)载体内,将N端带有6×His tag的USP目的基因片段克隆于p ET28a(+)载体内,并将两个重组质粒同时转化入同一宿主菌BL21(DE3)内利用IPTG低温诱导双基因共表达,选用"超声破碎法"提取共表达蛋白,色谱柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot分析纯化结果,Micro Cal i TC200法与小分子化合物20-羟基蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)相互作用进行活性分析。SDS-PAGE与Western Blot分析结果显示宿主菌中表达产物存在蛋白复合体,大小与预期相符,Micro Cal i TC200实验显示EcR-USP与20E有结合,即EcR-USP有活性。得到有活性的家蚕的EcR-USP的可溶性表达产物,为进一步对其进行结构与功能的研究奠定了基础。

昆虫蜕皮激素受体及其类似物的杀虫机制研究进展

昆虫的蜕皮、变态和繁殖受到蜕皮激素的严格调控。蜕皮激素作用靶标由蜕皮激素受体(ecdysteroidreceptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracleprotein,USP)组成,蜕皮激素与EcR/USP作用启动蜕皮级联反应过程。昆虫EcR具有种类或类群的特异性,研究其结构、功能和调控机理在开发环境友好型新药剂和基因调控开关等方面具有重要指导作用。该文介绍了昆虫EcR的结构和功能特点,蜕皮激素及其类似物与EcR/USP的分子作用方式,以及基于EcR/USP的新杀虫剂创制和基因调控开关设计等方面的重要进展。

昆虫蜕皮激素受体研究进展

昆虫的蜕皮激素(molting hormone,MH)是甾醇类激素,在昆虫体内的活性形式为20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)。在昆虫的正常发育过程中,昆虫的蜕皮、变态和繁殖受到蜕皮激素的调控。昆虫蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle,USP)均属于核受体超家族成员,具有核受体的结构特征,包括A/B域(转录激活域transactivation domain)、C域(DNA结合域DNA-binding domain,DBD)、D域(铰链域hinge region)、E域(配体结合域ligand binding domain,LBD)和F域。蜕皮激素受体在昆虫蜕皮、变态和繁殖等重要的生命过程中的级联反应启动位置,对昆虫的生长发育和繁殖的正常完成有着非常重要的作用。蜕皮激素通过与蜕皮激素受体和超气门蛋白组成的复合体相互作用,然后启动一系列级联反应的过程。本文介绍了EcR和USP的结构和功能,以及它们与蜕皮激素相互作用的机理,并对EcR在农业害虫防治等方面的应用进行了介绍,并讨论了研究中遇到的问题以及对未来的研究进行展望。

西方蜜蜂（Apismellifera）不同级型蜕皮激素早期应答因子ecr和usp的表达及功能分析

为探究蜕皮激素早期应答因子ecr和usp在不同级型的西方蜜蜂体内的表达及其他相关生物学功能和作用,本研究通过荧光定量PCR技术对不同级型、发育时期的西方蜜蜂中的ecr与usp表达水平进行检测。结果表明,ecr、usp在工蜂小幼虫体内的表达与参照相同,随后稍有增加,但在变态期急剧降至最低水平,而后的蛹期又逐步增加,在成年蜂时期的表达持续维持在较高水平;蜂王体内的变化趋势与工蜂基本类似,所不同的是各阶段的表达量都显著高于工蜂,且在产卵王体内的表达显著高于处女蜂王;雄蜂体内ecr的表达在小幼虫时期稍高,但此后至蛹期都一直处于较低的表达水平,至蛹后期才稍有增加,但羽化后水平较低,老龄雄蜂体内又稍有提高。但usp在雄蜂体内的表达却基本呈现出与发育时期无关的高表达,大致为参照的283倍。ecr与usp在三型蜂体内的这种表达模式揭示了MH不仅调控蜜蜂生长发育、蜕皮变态,还可能与蜜蜂的生殖有关,而usp在雄蜂体内的表达说明USP除了与Ec R组成活性复合体参与MH调控蜕皮与生殖外,还可能具有其他的生物学功能。该结果为进一步研究蜕皮激素及其效应因子的生物学功能提供了依据。