西伯利亚蓼铜伴侣蛋白与铜锌超氧化物歧化酶基因共转化烟草的耐盐性分析

为验证西伯利亚蓼铜伴侣蛋白基因(Ps ATX)和铜锌超氧化物歧化酶基因(Ps SOD)共转化的烟草是否具有耐盐功能,分别构建了植物单价表达载体pROKⅡ-Ps ATX、pROKⅡ-Ps SOD和双价表达载体pROKⅡ-Ps ATX-PsSOD,通过农杆菌介导遗传转化烟草,PCR验证转基因植株后测定了盐胁迫条件下转基因烟草的丙二醛(MDA)、活性氧、脯氨酸含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性,以此鉴定转基因植株的耐盐性。结果表明:(1)Ps ATX和Ps SOD基因已成功整合到烟草基因组中;(2)在100 mmol·L-1Na Cl处理条件下,转双价基因植株的MDA、活性氧、脯氨酸含量均比野生型和转单价基因植株低,而SOD活性则高于这两类植株。证明Ps ATX和Ps SOD基因共转化的烟草植株比转单价基因植株具有更强的耐Na Cl能力。本研究将为研究Ps ATX和Ps SOD基因的抗逆机制奠定分子基础。

肝细胞癌超氧化物歧化酶铜伴侣蛋白表达水平与肝癌恶性生物学指标的相关性

【目的】探讨肝细胞癌(HCC)超氧化物歧化酶铜伴侣蛋白(CCS)表达水平与肿瘤恶性生物学指标之间的相关性。【方法】收集2018年1月至2018年12月在中山大学附属第一医院行外科切除的10例肝细胞癌肿瘤标本以及患者的临床及病理资料,采用蛋白免疫印迹法(WB)检测肝癌及相应癌旁组织CCS表达水平,采用免疫组化(IHC)染色法检测Ki67,CD34,vimentin及glypican-3(GPC3)表达情况。用Wilcoxon秩和检验法分析CCS表达水平与各肝细胞癌恶性相关生物学指标Ki67,CD34,vimentin及GPC3表达水平之间的关系;采用Fisher精确概率法分析CCS表达水平与肝细胞癌患者临床及病理特征之间的关系。【结果】10例肝癌患者的肝癌组织标本中,7例CCS表达水平较癌旁组织低(7/10),3例CCS表达水平较癌旁组织高(3/10)。肝细胞癌CCS低表达组的Ki67,vimentin及GPC3表达水平高于CCS高表达组(Z=-2.400,P=0.016;Z=-2.423,P=0.015;Z=-2.400,P=0.016);肝细胞癌CCS低表达组CD34表达水平低于CCS低表达组(Z=-2.423,P=0.015);CCS高表达组与低表达组之间在年龄、性别、乙肝病史、肝硬化、术前AFP水平、肿瘤大小、ES分级、微血管侵犯各临床及病理特征方面均未呈现显著统计学差异。【结论】本研究显示多数肝细胞癌的CCS表达水平低于相应癌旁组织,且与CCS高表达的肝细胞癌相比,CCS低表达的肝细胞癌Ki67,vimentin及GPC3表达水平较高,提示CCS表达降低与肝细胞癌增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为相关。CCS低表达组CD34表达水平低于CCS高表达组,但其相关机制有待于进一步探究。本研究结果显示,与正常肝脏组织相比,CCS在肝癌中的表达多呈下降趋势,其表达水平可能成为肝细胞癌治疗预后的预测指标。

氨溴索对吸烟大鼠肺组织激活蛋白-1、铜锌超氧化物歧化酶表达的影响

目的通过研究氨溴索对吸烟大鼠肺组织中激活蛋白-1(AP-1)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)表达的影响,探讨氨溴索在慢性阻塞性肺疾病(COPD)抗氧化治疗中的作用及其机制。方法健康雄性Wistar大鼠30只随机分为对照组、吸烟组、氨溴索组,分别采用原位杂交半定量技术、免疫组织化学法和免疫细胞化学法检测支气管上皮细胞及肺泡巨噬细胞中AP-1(c-jun和c-fos亚单位)和CuZn-SOD mRNA及其蛋白的表达水平。结果吸烟组大鼠支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞c-jun、c-fos、CuZn-SOD mRNA及其蛋白表达水平明显高于对照组(均P<0.05);氨溴索组c-jun、c-fos mRNA及其蛋白、CuZn-SOD mRNA表达水平明显低于吸烟组(均P<0.01),而CuZn-SOD蛋白表达水平与其他两组相比无统计学差异(P>0.05)。结论氨溴索可以降低吸烟大鼠肺组织AP-1 mRNA及其蛋白和CuZn-SOD mRNA的表达,其可能通过降低AP-1的表达在COPD治疗中发挥一定的抗氧化作用。

实验性吸烟大鼠支气管肺组织中激活蛋白-1与铜锌超氧化物歧化酶表达的研究

目的观察不同吸烟时间大鼠支气管上皮细胞铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)和激活蛋白-1(AP-1)mRNA及其蛋白的表达水平以及二者的相关性,探讨激活蛋白-1(AP-1)在吸烟所致慢性阻塞性肺疾病(COPD)氧化/抗氧化失衡中的作用。方法自制大鼠实验性被动吸烟装置,建立吸烟引起慢性阻塞性肺疾病的动物模型,将40只大鼠随机分为不吸烟组、吸烟1月组、吸烟2月组、吸烟3月组,每组各10只。分别采用免疫组织化学法和原位杂交半定量技术检测支气管上皮细胞Cu-Zn SOD和AP-1(c-fos和c-jun)mRNA及其蛋白的表达水平。结果吸烟3月组大鼠出现了肺气肿的病理改变。吸烟各组大鼠支气管上皮细胞c-fos、c-jun mRNA及其蛋白的表达水平均较不吸烟组明显增高,差异有显著性(P<0.01),吸烟各组间比较差异亦有显著性(P<0.01);吸烟各组大鼠支气管上皮细胞Cu-Zn SOD mRNA及其蛋白的表达水平均较不吸烟组明显增高,差异有显著性(P<0.01),2月组较1月组增高,差异有显著性(P<0.01),3月组和2月组无明显差异,无统计学意义。结论随着吸烟时间的延长,大鼠支气管上皮细胞中c-fos和c-jun二者的表达逐渐增高,并且呈正相关,Cu-Zn SOD在吸烟1月和2月时表达较高,在吸烟3月时略有下降。提示AP-1在吸烟所致COPD氧化/抗氧化失衡中可能发挥重要的作用。

靶向抑制铜伴侣蛋白CCS逆转卵巢癌C13~*细胞的顺铂耐药性

顺铂(cisplatin),即二胺二氯铂/diaminedichloroplatinum(DDP),是治疗卵巢癌最有效的化疗药物;然而,耐药性是限制顺铂临床治疗效果的最重要因素。目前,卵巢癌对顺铂的耐药机制仍不十分清楚。超氧化物歧化酶1铜伴侣蛋白(copper chaperone for superoxide dismutase 1,CCS)介导Cu2+特异性传递给超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase1,SOD1),为维持细胞增殖和生存所必需;相反,抑制CCS可减缓肿瘤细胞增殖。本研究旨在证明,AMPK依赖的CCS表达与卵巢癌的顺铂耐药有关。实时定量PCR及免疫印迹结果显示,与顺铂敏感细胞株OV2008比较,顺铂耐药细胞株C13*中的CCS mRNA和蛋白质表达水平明显上调。shRNA靶向沉默CCS或采用抑制剂DC_AC50抑制CCS后,可明显增强顺铂对C13*细胞增殖的抑制作用,提示CCS高表达与顺铂耐药相关,而抑制CCS可逆转顺铂的耐药性。同样,免疫印迹结果证明,CCS在A549、H1944等6种不同肺癌细胞中的表达水平高低与顺铂敏感性密切相关。采用siRNA干扰CCS在A549细胞中的高表达,或在CCS低表达的H1944细胞中过表达CCS,可明显增加A549或减弱H1944细胞对顺铂的敏感性,进一步证明CCS表达与顺铂耐药性相关。此外,采用AMPK抑制剂化合物C阻断AMPKα-Thr172磷酸化(激活),即抑制AMPK信号通路,可明显抑制CCS在C13*细胞中的表达,提高其对顺铂的敏感性。以上研究结果提示,AMPK信号通路依赖的CCS表达参与肿瘤的顺铂耐药机制,而抑制CCS逆转顺铂耐药。本文的结果还提示,CCS有望成为克服顺铂耐药的潜在靶点。

穿透肽介导的铜-锌超氧化物歧化酶1融合蛋白的抗氧化作用及对脂肪干细胞移植修复脊髓损伤的促进作用

目的探讨穿透肽介导的铜-锌超氧化物歧化酶1融合蛋白（PEP-1-SOD1）在脊髓损伤早期的抗氧化作用及对脂肪干细胞（ADSCs）移植修复脊髓损伤的促进作用。方法体外分离培养SD大鼠ADSCs，并以携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的腺病毒感染ADSCs。取成年SD大鼠96只，以改良Allen法制作脊髓损伤模型，随机分为3组：盐水治疗组、ADSCs治疗组、PEP-1-SOD1联合ADSCs治疗组（联合治疗组），术后1、3、7 d各取8只大鼠分别行超氧化物歧化酶（SOD）活性检测及丙二醛（MDA）含量检测，术后7 d各取4只大鼠行细胞凋亡检测；术后1、2、3、4周行Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分，术后4周BBB评分后处死大鼠行神经元特异性核蛋白（NeuN）表达阳性细胞检测，对ADSCs治疗组及联合治疗组行脊髓损伤区域绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞检测。 结果术后7 d ADSCs治疗组SOD活性大于盐水治疗组（t＝3.882，P＝0.030），MDA含量小于盐水治疗组（t＝10.392 ，P＝0.002），联合治疗组SOD活性大于ADSCs治疗组（t＝4.690，P＝0.018），MDA含量小于ADSCs治疗组（t＝3.464，P＝0.031）。术后7 d联合治疗组细胞凋亡少于ADSCs治疗组（t＝13.416，P＝0.000），ADSCs治疗组细胞凋亡多于盐水治疗组（t＝12.000，P＝0.000）。术后4周，联合治疗组BBB评分为（18.59±1.54）分大于ADSCs治疗组[（11.90±1.72）分，t＝8.430，P＝0.000]；联合治疗组NeuN阳性细胞百分比为（61.65±12.65）%大于ADSCs治疗组的（31.45±5.76）%（t＝154.214，P＝0.000）；联合治疗组GFP阳性细胞数大于ADSCs治疗组（t＝64.325，P＝0.000）。 结论与单纯ADSCs移植比较，联合应用PEP-1-SOD1进一步增加损伤局部SOD活性，降低MDA含量，改善运动功能，PEP-1-SOD1发挥了协同效果，这可能与减少移植细胞凋亡有关。

PEP-1介导铜锌超氧化物歧化酶对帕金森病小鼠氧化应激损伤的保护作用

目的观察PEP-1-铜、锌超氧化物歧化酶(PEP-1-SOD1)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病小鼠行为学和氧化应激损伤的影响,探讨其可能的神经保护机制。方法 36只C57/BL小鼠随机分为正常组、模型组和PEP-1-SOD1组。模型组给MPTP腹腔注射,连续5 d;PEP-1-SOD1组连续腹腔注射MPTP5 d前给予PEP-1-SOD1腹腔注射3 d。通过爬杆实验观察小鼠行为学变化。取小鼠纹状体通过黄嘌呤氧化酶法检测铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,通过TBA法检测MDA含量。结果模型组小鼠爬杆能力明显下降,PEP-1-SOD1组处理的小鼠行为学异常明显改善(P<0.01)。模型组小鼠纹状体SOD1和GSH-Px活性明显降低,MDA含量显著升高(P<0.01)。同模型组比较,PEP-1-SOD1组小鼠纹状体SOD1和GSH-Px活性显著增高,MDA含量明显减少(P<0.01)。结论 PEP-1-SOD1具有神经保护作用,其机制可能与减轻氧化应激损伤、增强抗自由基损伤能力有关。

PEP-1-SOD1融合蛋白的表达及纯化

目的构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1,并进行PEP1SOD1融合蛋白表达和纯化。方法以pBluescriptIISKSOD1质粒为模板,PCR扩增SOD1cDNA。经酶切后,分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1,经测序证实构建成功后,分别转化E.coliBL21(DE3),表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白,并进行鉴定。结果SDSPAGE和Westernblot分析表明,分别在相对分子质量22000和26000处出现SOD1和PEP1SOD1目标表达条带,目的蛋白占菌体总蛋白的30%,两种表达蛋白以天然的、可溶性的形式存在。结论已成功地制备出SOD1和PEP1SOD1融合蛋白。

PEP-1-SOD1融合蛋白转导入小鼠海马组织的能力及时间关系

目的:研究PEP-1介导铜,锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD1)转导入小鼠海马组织的能力及时间关系.方法:健康雄性昆明小鼠随机分为SOD1组及PEP-1-SOD1组,分别经腹腔注射SOD1蛋白及PEP-1-SOD1融合蛋白200μg,于注射后1,2,4,8,24h等5个时间点分别取小鼠海马组织进行检测(n=5).Western Blot测定PEP-1-SOD1蛋白的表达;免疫荧光组织化学方法测定PEP-1-SOD1在海马组织的分布;黄嘌呤氧化酶法测定SOD1活性.结果:PEP-1-SOD1组注射后1h,小鼠海马组织在Mr约26×103处出现目的蛋白条带,4h达高峰,24h仍有蛋白转导;SOD1组未发现目的蛋白.免疫荧光检测发现PEP-1-SOD1组海马组织中出现特异性绿色荧光;SOD1组未发现绿色荧光.PEP-1-SOD1组酶活性于注射后1h升高至(61.7±2.9)×103U/g,4h达峰值(82.6±4.2)×103U/g,之后开始下降,24h仍明显高于SOD1处理组(P<0.01);SOD1组酶活性各时间点相比较差异无统计学意义.结论:PEP-1可以介导SOD1以天然活性形式转导进入小鼠海马组织,4h达高峰,并保持活性至少达24h.

PEP-1-SOD1融合蛋白抑制血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ型胶原的合成

目的研究穿透肽(PEP-1)介导的铜-锌超氧化物歧化酶1(SOD1)(PEP-1-SOD1)融合蛋白对血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)诱导的大鼠心脏成纤维细胞(CFbs)Ⅰ型胶原合成的影响,并探讨其机制。方法利用基因工程技术表达和纯化PEP-1-SOD1融合蛋白。提取原代大鼠CFbs并传代培养,采用2～5代细胞进行实验,实验分为对照组、ANGⅡ诱导组、SOD1预处理组和PEP-1-SOD1预处理组。SOD1预处理组和PEP-1-SOD1预处理组细胞分别以2μmol.L-1的SOD1和PEP-1-SOD1预处理2 h后,再给1μmol.L-1的ANGⅡ诱导24 h,用免疫荧光法检测细胞内超氧阴离子(O2-)水平,微量丙二醛(MDA)检测试剂盒检测各组细胞MDA含量。结果 Western blot和细胞免疫荧光结果显示PEP-1-SOD1成功穿透入CFbs;Western blot结果显示,与ANGⅡ诱导组比较,PEP-1-SOD1预处理组Ⅰ型胶原和α平滑肌肌动蛋白表达显著降低(P<0.01),细胞内O2-和MDA水平也显著降低(P<0.01)。结论 PEP-1-SOD1融合蛋白穿透入大鼠心脏CFbs内,通过降低细胞内O2-水平,抑制CFbs的激活,减少Ⅰ型胶原的合成。

PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠肝脏组织的能力及酶活性

目的研究PEP-1-SOD1融合蛋白转导入大鼠肝脏组织的能力及其酶活性。方法实验分为SOD1组和PEP1-SOD1组,分别经尾静脉注射500μgSOD1和500μgPEP-1-SOD1融合蛋白入大鼠体内,于0.5,1,2,4,8和24h时间点取肝脏(n=6,每组,每个时间点)。免疫荧光技术检测PEP-1-SOD1的转导能力。黄嘌呤氧化酶法测定肝脏组织SOD1活性。结果SOD1蛋白不能进入肝脏组织内。PEP-1-SOD1可转导入肝脏组织内,SOD1活性于注射后0.5h开始升高,1h达高峰,持续存在达24h,两组各个时间点比较,差异有统计学意义(P<0.01)。SOD1组内各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论PEP-1-SOD1以天然酶活性形式转导入肝脏组织,为进一步的动物模型实验及临床疾病进行蛋白质治疗提供理论基础。

PEP－1－SODl融合蛋白的制备、表达及纯化

目的：构建原核表达载体pQE30－PEP－1－SOD1，并进行PEP－1－SOD1融合蛋白表达和纯化。方法载体质粒pQE－30及模板质粒pUC57－PEP－1－SOD1分别进行酶切后，构建原核表达载体pQE30－PEP－1－SOD1载体。经测序证实构建成功后，转化JM109，表达PEP－1－SOD1融合蛋白，并进行鉴定。结果 SDS－PAGE电泳分析表明，位于相对分子质量约25×10^3处出现PEP－1－SOD1的目标表达条带；目的蛋白以天然的可溶性的形式存在。结论已成功制备出PEP－1－SOD1融合蛋白。

乐尔脉胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠大脑皮层组织中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表达的影响

目的:研究乐尔脉胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠大脑皮层组织中氧化应激损伤的影响及机制。方法:将65 只大鼠随机分为假手术组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、阳性对照组(脑心通胶囊,3.40 g/kg)和乐尔脉胶囊高、低剂量组(0.37、0.18 g/kg),每组13只。除假手术组大鼠行假手术外,其余各组大鼠均采用线栓法复制大鼠中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)模型。造模后24 h开始灌胃给药,每天给药1次,连续给药7 d。末次给药2 h后,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定大鼠脑缺血面积;苏木精-伊红(HE)染色后在显微镜下观察脑组织病理学变化;Western blot法检测大脑皮层组织中血红素加氧酶1(HO-1)、铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)、锰超氧化物歧化酶(SOD2)和核因子E2 相关因子2(Nrf2)蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠脑缺血面积显著增加(P<0.05),间质重度水肿,炎性细胞浸润明显;大脑皮层组织中HO-1和SOD1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),SOD2 和Nrf2 蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,乐尔脉胶囊高、低剂量组大鼠脑缺血面积均显著减小(P<0.05),间质水肿减轻,炎性细胞浸润减少,小胶质细胞增生减弱;大脑皮层组织中HO-1、SOD1、SOD2 和Nrf2 蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。结论:乐尔脉胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠具有一定改善作用,可能与上调皮层组织中抗氧化因子HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白的表达有关。

携带SOD1-p.A5S突变的1例肌萎缩侧索硬化患者病例报道及相关文献分析

目的肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种进行性和致命的神经退行性疾病。目前认为Cu/Zn超氧化物歧化酶1基因(Cu/Zn superoxide dismutase gene 1,SOD1)突变是导致家族性ALS的原因之一,对可疑ALS家族史的患者进行SOD1基因测序可能有帮助。本文首次报道中国籍汉族SOD1-p.A5S突变的肌萎缩侧索硬化1例,并总结其临床特征。方法与结果首次报道中国籍汉族SOD1-p.A5S突变的1例ALS临床患者并复习相关病例文献,总结其临床特征。研究病例为男性,34岁,以“双下肢无力2年,加重伴双手无力半年”之主诉入住西安交通大学第一附属医院神经内科,主要临床表现为逐渐进展的四肢无力,无吞咽困难,无认知功能障碍。入院后进一步完善常规检查及肌电图等排除其他诊断,并行基因检测。结合患者典型的临床表现和肌电图提示颈髓、胸髓和腰髓三个区域存在下运动神经元受累的证据,合理排除其他诊断及特征性基因检测结果,诊断为ALS。基因检测结果提示患者存在SOD1一号外显子c.13G>T(p.A5S)杂合突变,其母有可疑病史但已死亡未进行基因验证。出院后随访截至2022年8月21日,随访时间共38个月,病程62个月。进一步查阅文献报道的同一位点突变的其他患者的临床特点,总结发现本例突变患者与其他文献报道同一位点突变患者进展较慢。结论基因测序是诊断家族性ALS的有利工具。SOD1一号外显子c.13G>T(p.A5S)突变为罕见的致病性变异,该亚型患者进展较慢,进一步说明基因检测在ALS的诊断和预后判定中具有重要价值。

基于差异蛋白质组学解析一贯煎对大鼠肝硬化形成的影响

目的:基于差异蛋白质组学探讨一贯煎干预肝硬化的部分效应机制。方法:48只Wistar雄性大鼠随机分为正常组(n=12)及造模组(n=36),采用50%四氯化碳(carbonte tra-chloride,CCl4)-橄榄油溶液1mL/kg腹腔注射(2次/周,共9周)制备大鼠肝硬化模型。于开始造模后3周和6周分别随机处死6只大鼠,作药物干预前的动态观察,其余24只模型大鼠于开始造模后第7周首日随机分为模型组(n=12)及一贯煎干预组(n=12)。大鼠于第9周末全部处死取材。双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分离肝组织总蛋白,基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱及数据库查询鉴定差异表达蛋白质;差异蛋白质铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase,Cu/Zn SOD)和DJ-1表达采用蛋白印迹法及免疫组织化学方法进行验证。结果:获得分辨率高、重复性好的肝组织2-DE图谱,经质谱鉴定的50个差异蛋白质中,与氧化应激相关的5个蛋白质分别是Cu/ZnSOD、DJ-1、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽S-转移酶Yb-1亚基、醛酮还原酶7,A2。与正常组大鼠比较,模型组肝组织Cu/ZnSOD、DJ-1、谷胱甘肽S-转移酶及醛酮还原酶7,A2的表达均显著降低,其中Cu/ZnSOD、醛酮还原酶7,A2在造模3周、6周及9周后呈梯级下降,而DJ-1、谷胱甘肽S-转移酶于造模3周、6周及9周后均呈低水平表达;谷胱甘肽合成酶表达显著升高。治疗结束后与模型组比较,一贯煎组Cu/ZnSOD、DJ-1、谷胱甘肽S-转移酶及醛酮还原酶7,A2表达均明显增高,谷胱甘肽合成酶表达显著降低。蛋白印迹法及免疫组织化学验证了Cu/ZnSOD、DJ-1在蛋白表达水平的差异,与蛋白质组学结果基本一致。结论:抗氧化应激功能降低是CCl4致大鼠肝硬化的重要病理环节,提高抗氧化应激功能相关蛋白的表达可能是一贯煎治疗CCl4所致大鼠肝硬化的主要效应机制。

原核表达质粒pET15b-PEP-1-SOD1的构建

目的构建pET15b-PEP-1-SOD1原核表达质粒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,以含有全长人SOD1 cDNA的质粒(pBluescript II SK-SOD1)为模板,扩增出SOD1 cDNA,将SOD1 cDNA和人工合成的编码PEP-1的双链寡核苷酸克隆至pET15b原核表达载体上,进行酶切鉴定及测序分析。结果pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒经酶切鉴定含有SOD1 cDNA和编码PEP-1的片段,测序分析证实分别与GeneBank“AB087266”登录的人SOD1 cDNA和合成的PEP-1编码序列完全一致。结论成功地构建了pET15b-PEP-1-SOD1重组质粒,为制备PEP-1-SOD1融合蛋白提供了表达载体。

PEP-1肽介导人Cu,Zn-SOD转导入大鼠离体缺血再灌注损伤心脏

目的:构建原核表达载体pET15b-PEP-1-SOD1,观察PEP-1-SOD1融合蛋白在大鼠离体缺血再灌注损伤心肌组织内的转导能力和转导的目的蛋白是否具有酶活性。方法:构建原核表达载体pET15 b-SOD1和pET15b-PEP-1-SOD1,分别转化大肠杆菌,表达和纯化SOD1和PEP-1-SOD1融合蛋白。采用Langendorff灌流系统,大鼠离体心脏停灌30 min后复灌60 min建立缺血再灌注损伤模型。实验分为对照组,SOD1组,25,50,100μmol/L PEP-1-SOD1组。免疫荧光检测PEP-1-SOD1的转导效果,SOD试剂盒检测酶活性。结果:在荧光显微镜下,PEP-1-SOD1融合蛋白预处理组心肌组织中可见特异性的绿色荧光位于心肌细胞胞质内,25,50,100μmol/L组阳性率分别为32.6%,42.5%,60.9%。SOD1蛋白预处理组和对照组未见到绿色荧光。与对照组相比,PEP-1-SOD1各组SOD酶活性均显著增加(P<0.01),且SOD酶活性与PEP-1-SOD1浓度呈正相关,SOD1组与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:PEP-1-SOD1融合蛋白以天然有活性的形式穿透进入大鼠离体缺血再灌注损伤的心肌细胞,且具有剂量依赖性。转导入细胞内的PEP-1-SOD1蛋白具有酶活性。本研究为SOD1治疗由氧化应激所导致的各种疾病提供了一种有效的递送途径。

肝豆状核变性1例及家庭成员血清CP、SOD-1放免分析

用放免法测定血清铜蓝蛋白（ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ ，ＣＰ） 含量以诊断肝豆状核变性（ｈｅｐａｔｏｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＨＬＤ）患者，并对其家庭成员的ＣＰ也作了测定，结果表明对家庭成员测定ＣＰ虽不一定有助于ＨＬＤ 杂合子的筛查，但结合患者的临床表现有助于对ＨＬＤ 的分型。此外还测定了血清铜锌超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ１）的含量，表明在ＨＬＤ患者中血清ＳＯＤ－ １ 可能有升高，且可能与ＨＬＤ临床症状的产生相关。

PEP-1-SOD1预处理对脑梗死小鼠顶叶皮质的保护作用

目的 探讨PEP-1-铜,锌超氧化物歧化酶（PEP-1-SOD1）预处理对小鼠顶叶皮质神经元的保护作用.方法 将健康成年昆明小鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、PEP-1-SOD1组,每组各15只.后两组建立永久性大脑中动脉闭塞模型.造模前30min假手术组及模型组腹腔注射生理盐水200 μL,PEP-1-SOD1组注射PEP-1-SOD1 200 μg.24 h后取各组小鼠顶叶皮质,TTC染色测定梗死灶体积,TUNEL染色测定细胞凋亡,黄嘌呤氧化酶法测定SOD1活性,TBA法测定丙二醛（MDA）含量.结果 与模型组相比,PEP-1-SOD1组梗死灶体积明显缩小,凋亡细胞明显减少,SOD1活性明显升高,MDA含量明显下降,比较差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 PEP-1-SOD1预处理可有效减轻脑梗死后顶叶皮质缺血损伤.

真菌铜离子内稳态(homeostasis)调节的多样性

铜是生物体中必需的微量元素之一,作为多种氧化酶的辅助因子参与不同的生物反应,对于维持生命活动起到重要的作用。但在过量的情况下,无论是一价铜离子还是二价铜离子对于生物体都具有很强的细胞毒性,因此铜的代谢是受细胞严格调控的。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为模式生物对铜代谢的研究已取得了很大进展,对其它高等生物体内铜代谢及其重要生理功能提供了重要信息。本文对酿酒酵母中铜离子的吸收、转运以及在细胞内的代谢调控的新进展进行了归纳,并结合自己的研究综述了真菌铜代谢调节的共性与差异。