差速离心、密度梯度离心、超滤离心技术在骨髓间充质干细胞外泌体提取中的应用对比观察

目的观察差速离心、密度梯度离心、超滤离心技术在骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体提取中的应用,筛选外泌体最佳离心提取方法。方法取BMSCs培养48 h后收集细胞上清,平均分成A、B、C组,分别使用差速离心技术、密度梯度离心技术、超滤离心技术提取外泌体;记录各组外泌体提取时间;采用负染色技术观察各组外泌体形态;使用纳米颗粒跟踪分析仪测算各组外泌体浓度及大小;采用BCA法测定外泌体总蛋白浓度;采用Western blotting法检测各组外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、Alix。将肺微血管内皮细胞(PMVECs)分成5组,EC组上室加入PMVECs及培养基; LPS组上室加入PMVECs及含LPS的培养基(构建内皮细胞损伤模型); A、B、C组上室加入方法同LPS组,下室分别加入A、B、C组外泌体;采用葡聚糖渗漏实验检测外泌体内皮细胞通透性(观察外泌体对内皮细胞的修复作用),以内皮细胞通透指数表示。结果 A、B、C组的外泌体的提取时间分别为(180±8)、(203±10)、(40±5) min,A、B组外泌体的提取时间与C组相比,P均<0. 05。各组外泌体均为大小不等的椭圆形或圆形的膜性结构,边界清晰,但仅A组外泌体可见到典型的杯状结构。A、B、C组的外泌体浓度分别为(4. 46±0. 38)×108/m L、(5. 11±0. 16)×108/m L、(2. 18±0. 17)×108/m L,A、B组与C组外泌体浓度相比,P均<0. 05。A、B、C组的外泌体大小均为20～100 nm。A、B组外泌体总蛋白浓度及CD63、Alix的相对表达量均显著高于C组(P均<0. 05)。A、B、C、LPS、EC组的内皮细胞通透指数分别为2. 17±0. 15、1. 77±0. 32、2. 37±0. 42、2. 93±0. 15、1. 00±0. 00,A、B、C、LPS组的内皮细胞通透指数与EC组相比,P均<0. 05; A、B组的内皮细胞通透指数与LPS组相比,P均<0. 05。结论密度梯度离心技术虽耗时较长,但提取的外泌体纯度、浓度较高,对内皮细胞的修复作用较强,可以作为科研和临床研究的首选外泌体离心提取方法。

超滤离心质谱法筛选和鉴定当归四逆汤中的直接凝血酶抑制剂

目的:采用超滤离心质谱法筛选和鉴定当归四逆汤(DSD)中直接凝血酶(THR)抑制剂。方法:采用体外酶活性实验结合超滤离心质谱技术(UF-UPLC/Q-TOF/MS)筛选和鉴定当归四逆汤中THR的特异性结合配体。结果:当归四逆汤水提物表现出了较强的THR抑制活性,其IC50为0.119 41 mg/mL。使用UF-UPLC-DAD/LC-MS筛选并鉴定了17种潜在直接THR抑制剂,分别为藁本内脂、丁基苯酞、香芹酮、辛醇葡萄糖苷、Valenciaxanthin、当归内酯、甘草宁、Apo-10’-violaxanthal、香豆基棕榈酸、亚麻酸、环四(异)亮氨酸、环六(异)亮氨酸、环七(异)亮氨酸、氧化芍药苷、Kanzonol P、苯甲酰芍药苷、白芍苷R3。结论:超滤离心质谱法可以有效地筛选当归四逆汤中的潜在THR抑制剂,并为进一步确定天然产物中直接THR抑制剂提供实验依据。